Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)
Summary
Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.
Abstract
Identificatie van specifieke eiwit-DNA-interacties op het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Chromatine immunoprecipitatie in combinatie met high-throughput sequencing (ChIP-seq) wordt veel gebruikt om genoombrede bindingslocaties van DNA-bindende eiwitten te identificeren. De ChIP-seq-methode wordt echter beperkt door zijn heterogeniteit in lengte van gesoniceerde DNA-fragmenten en niet-specifiek achtergrond-DNA, wat resulteert in een lage mappingresolutie en onzekerheid op DNA-bindende locaties. Om deze beperkingen te overwinnen, maakt de combinatie van ChIP met exonucleasevertering (ChIP-exo) gebruik van 5′ tot 3′ exonucleasevertering om het heterogene formaat immunogeprecipiteerde DNA te trimmen naar de eiwit-DNA-crosslinking site. Exonuclease behandeling elimineert ook niet-specifiek achtergrond DNA. Het door de bibliotheek voorbereide en exonuclease verteerde DNA kan worden verzonden voor sequencing met hoge doorvoer. De ChIP-exo-methode maakt een bijna base-pair mapping resolutie mogelijk met een grotere detectiegevoeligheid en een verminderd achtergrondsignaal. Een geoptimaliseerd ChIP-exo-protocol voor zoogdiercellen en sequencing van de volgende generatie wordt hieronder beschreven.
Introduction
De locaties van eiwit-DNA interacties geven inzicht in de mechanismen van genregulatie. Chromatine immunoprecipitatie in combinatie met high-throughput sequencing (ChIP-seq) wordt al tien jaar gebruikt om genoombrede eiwit-DNA-interacties in levende cellen te onderzoeken1,2. De ChIP-seq-methode wordt echter beperkt door heterogeniteit in DNA-fragmentatie en ongebonden DNA-besmetting die leiden tot een lage mappingresolutie, valse positieven, gemiste oproepen en niet-specifiek achtergrondsignaal. De combinatie van ChIP met exonucleasevertering (ChIP-exo) verbetert de ChIP-seq-methode door ChIP-DNA bij te snijden tot de eiwit-DNA-crosslinkingpunten, wat een bijna basispaarresolutie en een laag achtergrondsignaal3,4,5biedt. De sterk verbeterde kaartresolutie en lage achtergrond van ChIP-exo maken het mogelijk om nauwkeurige en uitgebreide eiwit-DNA-bindingslocaties in het hele genoom te bepalen. ChIP-exo is in staat om functioneel verschillende DNA-bindende motieven, coöperatieve interacties tussen transcriptiefactoren (TF) en meerdere eiwit-DNA-crosslinking sites op een bepaalde genomische bindingslocatie te onthullen, niet detecteerbaar door andere genomische mapping methoden3,4,6,7.
ChIP-exo werd aanvankelijk gebruikt in ontluikende gist om de sequentiespecifieke DNA-binding van TF ‘s te onderzoeken, om de precieze organisatie van het transcriptie pre-initiatiecomplex en subnuclesosomale structuur van individuele histonen in het genoom4,8,9te bestuderen . Sinds de introductie in 20114, ChIP-exo is met succes gebruikt in vele andere organismen, waaronder bacteriën, muizen en menselijke cellen7,10,11,12,13,14,15,16,17. In 2016 gebruikten Rhee et al.14 ChIP-exo in zoogdierneuronen voor het eerst om te begrijpen hoe neuronale genexpressie werd gehandhaafd na de downregulatie van het programmeren van TF Lhx3, dat een heterodimercomplex vormt met een andere programmering TF Isl1. Deze studie toonde aan dat bij afwezigheid van Lhx3 Isl1 wordt gerekruteerd naar nieuwe neuronale versterkers gebonden door Onecut1 TF om genexpressie van neuronale effectorgenen te behouden. In deze studie onthulde ChIP-exo hoe meerdere TF’s celtype en celfasespecifieke DNA-regulerende elementen dynamisch herkennen op een combinatorische manier bij de mappingresolutie van near-nucleotide. Andere studies gebruikten ook de ChIP-exo-methode om het samenspel tussen eiwitten en DNA in andere zoogdiercellijnen te begrijpen. Han et al.7 gebruikten ChIP-exo om genoombrede organisatie van GATA1 en TAL1 TFs in muis erythroid cellen te onderzoeken met behulp van ChIP-exo. Deze studie vond dat TAL1 direct wordt gerekruteerd naar DNA in plaats van indirect door eiwit-eiwit interacties met GATA1 tijdens erythroid differentiatie. Recente studies gebruikten ook ChIP-exo om de genoombrede bindingslocaties van CTCF, RNA Polymerase II en histonsporen te profileren om epigenomische en transcriptionele mechanismen in menselijke cellijnen18,19te bestuderen .
Er zijn verschillende versies van het ChIP-exo protocol beschikbaar3,5,20. Deze ChIP-exo-protocollen zijn echter moeilijk te volgen voor onderzoeken die niet bekend zijn met de voorbereiding van de volgende generatie sequencingbibliotheek. Een uitstekende versie van het ChIP-exo-protocol werd gepubliceerd met gemakkelijk te volgen instructies en een video21, maar bevatte veel enzymatische stappen die een aanzienlijke hoeveelheid tijd nodig hebben om te voltooien. Hier rapporteren we een nieuwe versie van het ChIP-exo-protocol met verminderde enzymatische stappen en incubatietijden, en uitleg voor elke enzymatische stap21. Eindreparatie en dA-tailingreacties worden in één stap gecombineerd met behulp van endprep-enzym. De incubatietijden voor index- en universele adapter ligatiestappen worden verminderd van 2 uur tot 15 minuten met behulp van een ligatieversterker. De kinasereactie na de indexadapter ligatiestap die in het vorige ChIP-exo-protocol wordt beschreven, wordt verwijderd. In plaats daarvan wordt tijdens de oligo-DNA-synthese een fosfaatgroep toegevoegd aan een van de 5′-uiteinden van de indexadapter (tabel 1), die zal worden gebruikt voor de lamda-exonucleaseverteringsstap. Terwijl het vorige ChIP-exo-protocol recjf exonucleasevertering gebruikte om enkelstrengs DNA-verontreinigingen te elimineren, wordt deze spijsverteringsstap hier verwijderd omdat het niet van cruciaal belang is voor de kwaliteit van de ChIP-exo-bibliotheek. Bovendien wordt voor het zuiveren van omgekeerd gekruist DNA na ChIP-elutie een magnetische kralenzuiveringsmethode gebruikt in plaats van de extractiemethode fenol:chloroform:isoamylalcohol (PCIA). Dit vermindert de incubatietijd van DNA-extractie. Belangrijk is dat het de meerderheid van de adapterverteerders verwijdert die zijn gevormd tijdens indexadapter ligatie, wat van invloed kan zijn op de efficiëntie van ligatiegemedieerde PCR.
Het hier gepresenteerde ChIP-exo-protocol is geoptimaliseerd voor de detectie van nauwkeurige eiwit-DNA-interacties in zoogdierneuronen die zijn onderscheiden van embryonale stamcellen (ES)-cellen van muizen. Kort, geoogste en gekruiste neuronale cellen worden gelyseerd, zodat chromatine kan worden blootgesteld aan sonicatie, vervolgens gesoniceerd zodat dna-fragmenten van de juiste grootte worden verkregen (figuur 1). Antilichaamomhulde kralen worden vervolgens gebruikt om selectief gefragmenteerde, oplosbare chromatine te immunoprecipiteren aan het eiwit van belang. Terwijl het immunogeprecipiteerde DNA nog op de kralen zit, worden eindreparatie, ligatie van sequencingadapters, invulreactie en 5′ tot 3′ lambda exonucleaseverteringsstappen uitgevoerd. De exonucleaseverteringsstap geeft ChIP-exo zijn ultrahoge resolutie en hoge signaal-ruisverhouding. Lambda exonuclease trimt het immunogeprecipiteerde DNA een paar baseparen (bp) van de crosslinking site, waardoor besmet dna wordt afgebroken. Het met exonuclease behandelde ChIP-DNA wordt ontlokt uit de met antilichamen bedekte kralen, eiwit-DNA-crosslinks worden omgekeerd en eiwitten worden afgebroken. DNA wordt geëxtraheerd en gedenatureerd tot enkelstrengs ChIP-DNA, gevolgd door primergloeien en uitbreiding om dubbelstrengs DNA (dsDNA) te maken. Vervolgens wordt ligatie van een universele adapter naar de met exonuclease behandelde uiteinden uitgevoerd. Het resulterende DNA wordt gezuiverd, vervolgens PCR versterkt, gel gezuiverd en onderworpen aan sequencing van de volgende generatie.
Het ChIP-exo protocol is langer dan het ChIP-seq protocol, maar is technisch gezien niet erg uitdagend. Elk succesvol immunogeprecipiteerd ChIP-DNA kan worden onderworpen aan ChIP-exo, met verschillende extra enzymatische stappen. De opmerkelijke voordelen van ChIP-exo, zoals ultrahoge kaartresolutie, een verminderd achtergrondsignaal en verminderde vals-positieve en negatieven, met betrekking tot genomische bindingssites, wegen zwaarder dan de tijdskosten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol wordt ChIP gevolgd door exonucleasevertering gebruikt om DNA-bibliotheken te verkrijgen voor de identificatie van eiwit-DNA-interacties in zoogdiercellen met een ultrahoge kaartresolutie. Veel variabelen dragen bij aan de kwaliteit van het ChIP-exo experiment. Kritieke experimentele parameters omvatten de kwaliteit van antilichamen, optimalisatie van sonicatie en het aantal LM-PCR-cycli. Deze kritische experimentele parameters zijn ook wat ChIP-exo experimenten kan beperken en zullen hieronder worden besp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het lid van het Rhee-laboratorium voor het delen van ongepubliceerde gegevens en waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door De Raad van het Onderzoek van de Natuurwetenschappen en van de Techniek van Canada (NSERC) toekenning RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L., A, J. e. l. t. s. c. h., Rots, M. G. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842 (2018).
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
