Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)
Summary
La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell’esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.
Abstract
L’identificazione di specifiche interazioni proteina-DNA sul genoma è importante per comprendere la regolazione genica. L’immunoprecipitazione della cromatina accoppiata con il sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è ampiamente utilizzata per identificare le posizioni di legame a livello genomico delle proteine leganti il DNA. Tuttavia, il metodo ChIP-seq è limitato dalla sua eterogeneità nella lunghezza dei frammenti di DNA sonicato e del DNA di fondo non specifico, con conseguente bassa risoluzione di mappatura e incertezza nei siti di legame con il DNA. Per superare questi limiti, la combinazione di ChIP con digestione esonucleasi (ChIP-exo) utilizza la digestione delle esonucleasi da 5′ a 3′ per tagliare il DNA immunoprecipitato di dimensioni eterogenee al sito di reticolamento proteina-DNA. Il trattamento con esonucleasi elimina anche il DNA di fondo non specifico. Il DNA preparato dalla libreria e digerito con esonucleasi può essere inviato per il sequenziamento ad alta produttività. Il metodo ChIP-exo consente una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi con una maggiore sensibilità di rilevamento e un segnale di fondo ridotto. Di seguito è descritto un protocollo ChIP-exo ottimizzato per le cellule di mammifero e il sequenziamento di nuova generazione.
Introduction
Le posizioni delle interazioni proteina-DNA forniscono informazioni sui meccanismi di regolazione genica. L’immunoprecipitazione della cromatina accoppiata con il sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è stata utilizzata per un decennio per esaminare le interazioni proteina-DNA a livello genomico nellecellule viventi 1,2. Tuttavia, il metodo ChIP-seq è limitato dall’eterogeneità nella frammentazione del DNA e dalla contaminazione del DNA non legato che porta a bassa risoluzione di mappatura, falsi positivi, chiamate perse e segnale di fondo non specifico. La combinazione di ChIP con digestione dell’esonucleasi (ChIP-exo) migliora il metodo ChIP-seq tagliando il DNA ChIP ai punti di collegamento incrociato proteina-DNA, fornendo una risoluzione vicina alla coppia di basi e un basso segnale di fondo3,4,5. La risoluzione di mappatura notevolmente migliorata e il basso background fornito da ChIP-exo consentono di determinare posizioni di legame proteina-DNA accurate e complete in tutto il genoma. ChIP-exo è in grado di rivelare motivi di legame del DNA funzionalmente distinti, interazioni cooperative tra fattori di trascrizione (TF) e più siti di collegamento incrociato proteina-DNA in una certa posizione di legame genomico, non rilevabili da altri metodi di mappaturagenomica 3,4,6,7.
ChIP-exo è stato inizialmente utilizzato nel lievito in erba per esaminare il legame dna specifico della sequenza dei TF, per studiare l’organizzazione precisa del complesso di pre-iniziazione della trascrizione e la struttura sub-nucleosomica dei singoli istoniattraverso il genoma 4,8,9. Dalla sua introduzione nel 20114, ChIP-exo è stato utilizzato con successo in molti altri organismi tra cui batteri, topi e cellule umane7,10,11,12,13,14,15,16,17. Nel 2016, Rhee et al. Questo studio ha dimostrato che in assenza di Lhx3, Isl1 viene reclutato in nuovi esaltatori neuronali legati da Onecut1 TF per mantenere l’espressione genica dei geni dell’effettore neuronale. In questo studio, ChIP-exo ha rivelato come più TF riconoscano dinamicamente il tipo di cellula e gli elementi regolatori del DNA specifici dello stadio cellulare in modo combinatorio a una risoluzione di mappatura quasi nucleotidica. Altri studi hanno anche usato il metodo ChIP-exo per comprendere l’interazione tra proteine e DNA in altre linee cellulari di mammiferi. Han et al.7 usò chip-exo per esaminare l’organizzazione a livello genomico dei TF GATA1 e TAL1 nelle cellule erythroid del topo usando chIP-exo. Questo studio ha scoperto che tal1 viene reclutato direttamente nel DNA piuttosto che indirettamente attraverso interazioni proteina-proteina con GATA1 durante la differenziazione erythroid. Studi recenti hanno anche utilizzato ChIP-exo per profilare le posizioni di legame a livello genomico di CTCF, RNA Polimerasi II e segni istonografici per studiare i meccanismi epigenomici e trascrizionale nelle lineecellulari umane 18,19.
Esistono diverse versioni del protocollo ChIP-exo disponibili3,5,20. Tuttavia, questi protocolli ChIP-exo sono difficili da seguire per le ricerche che non hanno familiarità con la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione. Un’eccellente versione del protocollo ChIP-exo è stata pubblicata con istruzioni facili da seguire e un video21, ma conteneva molti passaggi enzimatici che richiedono una notevole quantità di tempo per il completamento. Qui si segnala una nuova versione del protocollo ChIP-exo contenente passaggi enzimatici ridotti e tempi di incubazione e spiegazioni per ogni fase enzimatica21. Le reazioni di riparazione finale e di coda dA sono combinate in un unico passaggio utilizzando l’enzima di preparazione finale. I tempi di incubazione per i passaggi di lisciviazione dell’indice e dell’adattatore universale sono ridotti da 2 h a 15 minuti utilizzando un esaltatore di legatura. La reazione della chinasi dopo il passaggio di legatura della scheda di indice descritto nel precedente protocollo ChIP-exo è stata rimossa. Al contrario, durante la sintesi del DNA dell’oligo viene aggiunto un gruppo fosfato a una delle 5′ estremità dell’adattatore indice (Tabella 1), che verrà utilizzato per la fase di digestione dell’esonucleasi lambda. Mentre il precedente protocollo ChIP-exo utilizzava la digestione dell’esonucleasi RecJf per eliminare i contaminanti di DNA a singolo filamento, questo passaggio di digestione viene rimosso qui perché non è fondamentale per la qualità della libreria ChIP-exo. Inoltre, per purificare il DNA inverso incrociato dopo l’eluizione del ChIP, viene utilizzato un metodo di purificazione magnetica delle perline al posto del metodo di estrazione fenolo:cloroformio:alcol isoamile (PCIA). Ciò riduce i tempi di incubazione dell’estrazione del DNA. È importante sottolineare che rimuove la maggior parte dei dimeri della scheda formati durante la legatura della scheda di indicizzazione, il che può influire sull’efficienza della PCR mediata dalla legatura.
Il protocollo ChIP-exo qui presentato è ottimizzato per il rilevamento di precise interazioni proteina-DNA nei neuroni dei mammiferi differenziati dalle cellule staminali embrionali del topo (ES). In breve, le cellule neuronali raccolte e incrociate vengono lese, per consentire alla cromatina di essere esposta alla sonicazione, quindi sonicate in modo da ottenere frammenti di DNA di dimensioni appropriata (Figura 1). Le perline rivestite di anticorpi vengono quindi utilizzate per immunoprecipitato selettivamente la cromatina frammentata e solubile alla proteina di interesse. Mentre il DNA immunoprecipitato è ancora sulle perline, vengono eseguite la riparazione finale, la legatura degli adattatori di sequenziamento, la reazione di riempimento e le fasi di digestione delle esonucleasi lambda da 5′ a 3 ‘. La fase di digestione dell’esonucleasi è ciò che conferisce a ChIP-exo la sua altissima risoluzione e l’elevato rapporto segnale-rumore. L’esonucleasi lambda taglia il DNA immunoprecipitato alcune coppie di basi (bp) dal sito di reticolamento, causando così la degradazione del DNA contaminante. Il DNA ChIP trattato con esonucleasi viene eluita dalle perline rivestite di anticorpi, i collegamenti incrociati proteina-DNA sono invertiti e le proteine sono degradate. Il DNA viene estratto e denaturato in DNA ChIP a singolo filamento, seguito dalla ricottura del primer e dall’estensione per realizzare DNA a doppio filamento (dsDNA). Successivamente, viene eseguita la legatura di un adattatore universale alle estremità trattate con esonucleasi. Il DNA risultante viene purificato, quindi amplificato pcr, purificato in gel e sottoposto a sequenziamento di nuova generazione.
Il protocollo ChIP-exo è più lungo del protocollo ChIP-seq, ma non è molto impegnativo dal punto di vista tecnico. Qualsiasi DNA ChIP immunoprecipitato con successo può essere sottoposto a ChIP-exo, con diversi passaggi enzimatici aggiuntivi. I notevoli vantaggi del ChIP-exo, come la risoluzione di mappatura ultra-alta, un segnale di fondo ridotto e la diminuzione di falsi positivi e negativi, per quanto riguarda i siti di legame genomico, superano il costo del tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, il ChIP seguito dalla digestione dell’esonucleasi viene utilizzato per ottenere librerie di DNA per l’identificazione delle interazioni proteina-DNA nelle cellule dei mammiferi ad altissima risoluzione di mappatura. Molte variabili contribuiscono alla qualità dell’esperimento ChIP-exo. I parametri sperimentali critici includono la qualità degli anticorpi, l’ottimizzazione della sonicazione e il numero di cicli LM-PCR. Questi parametri sperimentali critici sono anche ciò che può limitare gli espe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il membro del laboratorio Rhee per aver condiviso dati inediti e preziose discussioni. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione RGPIN-2018-06404 (H.R.) del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
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