Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine präzise Laminektomie für die Induktion von stabilen Querbandverletzungen im Mausmodell mit minimalen Kollateralschäden für die Rückenmarksverletzungsforschung erstellt wird.

Abstract

Rückenmarksverletzungen (SCI) führen weitgehend zu irreversiblen und dauerhaften Funktionsverlusten, am häufigsten als Folge eines Traumas. Mehrere Behandlungsmöglichkeiten, wie z. B. Zelltransplantationsmethoden, werden erforscht, um die schwächenden Behinderungen zu überwinden, die sich aus SCI ergeben. Die meisten präklinischen Tierversuche werden in Nagetiermodellen von SCI durchgeführt. Während Rattenmodelle von SCI weit verbreitet sind, haben Mausmodelle weniger Aufmerksamkeit erhalten, obwohl Mausmodelle erhebliche Vorteile gegenüber Rattenmodellen haben können. Die geringe Größe von Mäusen entspricht niedrigeren Tierwartungskosten als bei Ratten, und die Verfügbarkeit zahlreicher transgener Mausmodelle ist für viele Arten von Studien von Vorteil. Die Induzieren von wiederholbaren und präzisen Verletzungen bei den Tieren ist die haupte Herausforderung für die SCI-Forschung, die bei kleinen Nagetieren eine hochpräzise Chirurgie erfordert. Das Transsektions-Verletzungsmodell war in den letzten zehn Jahren ein häufig verwendetes Verletzungsmodell für die transplantationsbasierte therapeutische Forschung, aber eine standardisierte Methode zur Induktion einer vollständigen Transektionsverletzung bei Mäusen existiert nicht. Wir haben ein chirurgisches Protokoll entwickelt, um eine vollständige Transsektionsverletzung bei C57BL/6-Mäusen auf Brustwirbelstufe 10 (T10) zu induzieren. Das Verfahren verwendet einen kleinen Spitzenbohrer anstelle von Rongeurs, um die Lamina präzise zu entfernen, nach der eine dünne Klinge mit abgerundeter Schneidkante verwendet wird, um die Rückenmarkstransektion zu induzieren. Diese Methode führt zu reproduzierbaren Transektionsverletzungen bei kleinen Nagetieren mit minimalen Kollateralmuskel- und Knochenschäden und minimiert daher Störfaktoren, insbesondere dort, wo verhaltensfunktionelle Ergebnisse analysiert werden.

Introduction

Rückenmarksverletzungen (SCI) sind ein komplexes medizinisches Problem, das zu drastischen Veränderungen in Gesundheit und Lebensstil führt. Es gibt keine Heilung für SCI, und die Pathophysiologie von SCI ist nicht gründlich verstanden. Tier-SCI-Modelle, insbesondere Nagetiermodelle, bieten ein unschätzbares Werkzeug für die Erprobung neuer Behandlungen und werden seit Jahrzehnten zur Erforschung von SCI eingesetzt. Bis heute haben über 72% der präklinischen SCI-Studien Rattenmodelle verwendet, verglichen mit nur 16%, die^Mäuse1 verwendet haben. Obwohl Ratten aufgrund ihrer größeren Größe und der Tendenz, Hohlräume zu bilden, die menschlichen GGB ähneln, traditionell die bevorzugten Modelltiere für die Untersuchung neuartiger therapeutischer Ansätze sind, werden Mäuse (einschließlich vieler transgener Mausmodelle) jetzt häufiger verwendet, um zelluläre und molekulare Mechanismen des SCI²zu untersuchen. Das Mausmodell bietet zusätzliche Vorteile in Bezug auf eine einfachere Handhabung, schnellere Reproduktionsraten und niedrigere Kosten als Ratten; Mäuse weisen auch einen hohen Grad an genomischer Ähnlichkeit mit Menschen^{auf 1,2,3}. Der Hauptnachteil des Mausmodells wurde als die deutlich kleinere Größe identifiziert, die Herausforderungen für chirurgische Eingriffe zur Bildung und Behandlung von Rückenmarksverletzungen^{schafft 4,5}.

Es gibt eine Lücke in der vorhandenen Literatur, die die Notwendigkeit eines robusten und reproduzierbaren chirurgischen Protokolls unterstreicht, um stabile SCI im Mausmodell zu induzieren. Daher bieten wir einen neuartigen und präzisen chirurgischen Ansatz in diesem Protokoll, um diese Einschränkungen zu überwinden. Dieses Protokoll enthält detaillierte Richtlinien, um eine Transektionsverletzung bei Mäusen zu induzieren, da dieser Verletzungstyp als der am besten geeignete für die Untersuchung regenerativer und degenerativer Veränderungen nach einer Verletzung⁶, sowie Neuroplastizität, neuronale Schaltkreise und Gewebe-Engineering-Ansätze⁷anerkannt wurde. Wir haben uns entschieden, die Verletzung in der unteren Brustregion zu induzieren, da Thoraxniveau SCI am häufigsten in der Literatur verwendet wird¹.

Protocol

Alle Verfahren wurden mit Zustimmung der Griffith University Animal Ethics Committee (ESK/04/16 AEC und MSC/04/18 AEC) nach den Richtlinien des National Health and Medical Research Council of Australia durchgeführt. 1. Tieraufbauverfahren für die Operation Anästhesisieren und stabilisieren Sie das Tier. Verwenden Sie 8–10 Wochen alte weibliche C57BL/6 Mäuse. Verwenden Sie 5% Isofluran in 1 L/min Sauerstoff zur Induktion der Anästhesie. Zur Aufrechterhaltung der Anästh…

Representative Results

Die resultierende Methode, wie in Abbildung 1dargestellt, beinhaltet eine angemessene Stabilisierung der Maus (Abbildung 1A) und eine gute Visualisierung der Wirbelsäule und des paraspinösen Gewebes (Abbildung 1B). Spinöse Prozesse und Laminae können mit minimaler Muskelsektion und Blutverlust klar visualisiert werden(Abbildung 1C, hervorgehobene Zone). Das Feinspitzenbohren wird wie in <strong clas…

Discussion

Diese Methode induziert eine vollständige Transsektionsverletzung auf T10-Wirbelebene bei Mäusen, was zu einer vollständigen Querschnittslähmung des Tieres unterhalb des Verletzungsniveaus führt. Insgesamt führt diese Methode zu minimalen Blutungen, vernachlässigbaren Kollateralschäden und einer stabilen, reproduzierbaren Verletzung. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Methoden der Transektion ohne Laminektomie¹⁰bietet diese Methode die Vorteile in Bezug auf die direkte Visualisierung …

Materials

Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor – 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60×60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material – SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material – Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug