Indução da lesão da medula espinhal tipo transssecção completa em camundongos

Summary

Este protocolo descreve como criar uma laminectomia precisa para indução de lesão medular do tipo transecção estável no modelo do camundongo, com danos colaterais mínimos para a pesquisa de lesão medular.

Abstract

A lesão medular (SCI) leva em grande parte à perda irreversível e permanente da função, mais comumente como resultado de um trauma. Várias opções de tratamento, como métodos de transplante celular, estão sendo pesquisadas para superar as deficiências debilitantes decorrentes da SCI. A maioria dos ensaios pré-clínicos em animais são realizados em modelos de roedores de SCI. Embora os modelos de ratos de SCI tenham sido amplamente utilizados, os modelos de mouse têm recebido menos atenção, embora os modelos de mouse possam ter vantagens significativas sobre os modelos de ratos. O pequeno tamanho dos camundongos equivale a menores custos de manutenção animal do que para ratos, e a disponibilidade de inúmeros modelos de camundongos transgênicos é vantajosa para muitos tipos de estudos. Induzir lesões repetidas e precisas nos animais é o principal desafio para a pesquisa de SCI, que em pequenos roedores requer cirurgia de alta precisão. O modelo de lesão do tipo transeção tem sido um modelo de lesão comumente usado na última década para pesquisas terapêuticas baseadas em transplante, no entanto, um método padronizado para induzir uma lesão completa do tipo transeção em camundongos não existe. Desenvolvemos um protocolo cirúrgico para induzir uma lesão completa do tipo transecção em camundongos C57BL/6 no nível vertebral torácico 10 (T10). O procedimento utiliza uma pequena broca de ponta em vez de rongeurs para remover precisamente a lâmina, após a qual uma lâmina fina com borda arredondada é usada para induzir a transeção medular. Este método leva a lesões reprodutíveis do tipo transecção em pequenos roedores com dano muscular e ósseo colateral mínimo e, portanto, minimiza fatores de confusão, especificamente onde os desfechos funcionais comportamentais são analisados.

Introduction

A lesão medular (SCI) é um problema médico complexo que resulta em mudanças drásticas na saúde e no estilo de vida. Não há cura para a SCI, e a fisiopatologia da SCI não é completamente compreendida. Os modelos de SCI animal, em particular modelos de roedores, oferecem uma ferramenta inestimável para testar novos tratamentos, e têm sido usados para explorar SCI por décadas. Até o momento, mais de 72% dos estudos pré-clínicos de SCI empregaram modelos de ratos, em comparação com meros 16% que usaram camundongos¹. Embora os ratos, devido ao seu maior tamanho e tendência a formar cavidades semelhantes às SCIs humanas, tenham sido tradicionalmente os animais modelo preferidos para estudar novas abordagens terapêuticas, os camundongos (incluindo muitos modelos de camundongos transgênicos) estão sendo usados com mais frequência para estudar mecanismos celulares e moleculares do SCI². O modelo de mouse oferece benefícios adicionais em termos de manuseio mais fácil, taxas reprodutivas mais rápidas e custos mais baixos do que ratos; camundongos também apresentam alto grau de similaridade genômica com humanos^1,2,3. A maior desvantagem do modelo de camundongos tem sido identificada como o tamanho significativamente menor que cria desafios para intervenções cirúrgicas para a criação e tratamento de lesões medular^4,5.

Há uma lacuna na literatura existente que destaca a necessidade de um protocolo cirúrgico robusto e reprodutível para induzir SCI estável no modelo do mouse. Por isso, fornecemos uma abordagem cirúrgica nova e precisa neste protocolo para superar essas limitações. Este protocolo fornece diretrizes aprofundadas para induzir uma lesão tipo transeção em camundongos, uma vez que este tipo de lesão tem sido reconhecido como o mais adequado para estudar alterações regenerativas e degenerativas após uma lesão⁶, bem como neuroplasticidade, circuitos neurais e abordagens de engenharia tecidual⁷. Optamos por induzir a lesão na região torácica inferior, uma vez que o nível torácico SCI é mais utilizado na literatura¹.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética Animal da Universidade Griffith (ESK/04/16 AEC e MSC/04/18 AEC) sob as diretrizes do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália. 1. Procedimento de configuração animal para a cirurgia Anestesiar e estabilizar o animal. Use camundongos C57BL/6 fêmeas de 8 a 10 semanas. Use 5% de isoflurane em 1 L/min de oxigênio para indução de anestesia. Para manutenção da anestesia, use 1…

Representative Results

O método resultante, como retratado na Figura 1,envolve estabilização adequada do camundongo (Figura 1A) e boa visualização da coluna vertebral e tecido paraspinous(Figura 1B). Processo espinhoso e laminae podem ser claramente visualizados com dissecção muscular mínima e perda de sangue(Figura 1C, zona destacada). A perfuração da ponta fina é realizada como mostrado na Fi…

Discussion

Este método induz uma lesão completa do tipo transeção no nível vertebral T10 em camundongos, o que resulta em paraplegia completa do animal, abaixo do nível de lesão. No geral, este método resulta em sangramento mínimo, danos colaterais insignificantes e uma lesão estável e reprodutível. Em comparação com os métodos de transeção publicados anteriormente sem laminectomia^10,este método oferece os benefícios em termos de visualização direta sem manipular a curvatura da coluna ve…

Materials

Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	Post-operative care drug
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	Consumable
Castroviejo needle holder, locking	ProSciTech	T149C	Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled	ProSciTech	TXD101A-X	Reusable
Cotton swabs (5pcs)	Multigate	21-893	Consumable
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	Cordless rotary tool
Dressing forceps fine	Multigate	06-306	Single use disposable
Drill bits	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	Reusable
Dumont #7b forceps	Fine Science Tools	11270-20	Reusable
Dumont tweezers, style 5	ProSciTech	T05-822	Reusable
Fur trimmer	WAHL	WA9884-312	Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm	ProSciTech	TY-3032	Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	Anaesthetic agent
Colibri Retractor – 4cm	Fine Science Tools	17000-04	Reusable
Scalpel handle	ProSciTech	T133	Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5	Medline	MSG5475	Consumable
Sodium Chloride 0.9%	STS	PHA19042005	Consumable
Sterile Dressing Pack	Multigate	08-709	Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60×60 cm	Multigate	29-220	Single use disposable
Surgical spirit 100 mL	Provet	# SURG SP	Consumable
Suture Material – SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	Silk Suture
Suture Material – Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	Post-operative care drug