Monitoraggio della sopravvivenza del virus influenzale al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale
Summary
Qui è riportato un protocollo per la quantificazione di particelle virali infettive utilizzando il monitoraggio in tempo reale dell’impedenza elettrica delle cellule infette. Un’applicazione pratica di questo metodo è presentata quantificando il decadimento del virus dell’influenza A in diversi parametri fisico-chimici che imitano le condizioni ambientali.
Abstract
I metodi per la quantificazione delle particelle virali rappresentano un aspetto critico di molti studi di virologia. Sebbene esistano diverse tecniche affidabili, richiedono molto tempo o non sono in grado di rilevare piccole variazioni. Qui viene presentato un protocollo per la quantificazione precisa del titolo virale analizzando le variazioni di impedenza elettrica delle cellule infette in tempo reale. L’impedenza cellulare viene misurata attraverso biosensori a microelettrodi d’oro situati sotto le cellule in micropiastre, in cui la grandezza dipende dal numero di cellule, nonché dalle loro dimensioni e forma. Questo protocollo consente l’analisi in tempo reale della proliferazione cellulare, della vitalità, della morfologia e della migrazione con maggiore sensibilità. Viene inoltre fornito un esempio di applicazione pratica quantificando il decadimento del virus dell’influenza A (IAV) sottoposto a vari parametri fisico-chimici che influenzano l’infettività virale nel tempo (cioè temperatura, salinità e pH). Per tali applicazioni, il protocollo riduce il carico di lavoro necessario, generando al contempo dati di quantificazione precisi delle particelle virali infettive. Permette il confronto delle pendenze di inattivazione tra diversi IAV, che riflette la loro capacità di persistere in un determinato ambiente. Questo protocollo è facile da eseguire, è altamente riproducibile e può essere applicato a qualsiasi virus che produce effetti citopatici in coltura cellulare.
Introduction
La trasmissione di un virus si basa sulla combinazione di diversi fattori. Per un virus secreto nell’ambiente, la sua trasmissione dipende anche dalla capacità di persistere in condizioni al di fuori dell’ospite. Studiare l’inattivazione virale in generale è, quindi, un passo cruciale per aiutare le autorità sanitarie nazionali e i responsabili politici ad attuare misure di controllo e biosicurezza.
La conoscenza della persistenza del virus in ambienti naturali e di laboratorio è aumentata considerevolmente nell’ultimo decennio. Nel caso dei virus dell’influenza A (IAV), le loro vie di trasmissione sottopongono le particelle virali a una vasta gamma di condizioni ambientali. In particolare, possono essere trasmessi attraverso 1) vie fecali-orali attraverso l’acqua (cioè virus aviari), o 2) contatto diretto o indiretto da fomiti contaminati, nonché aerosol e goccioline respiratorie (cioè virus di pollame e mammiferi)1. In ogni caso, gli IAV sono sottoposti a vari parametri fisico-chimici (pH, salinità, temperatura e umidità), che influenzano più o meno rapidamente la loro infettività2,3,4,5,6,7,8,9. È di grande importanza, soprattutto per quanto riguarda i virus zoonotici e pandemici, valutare il potenziale dei fattori ambientali di influenzare le dinamiche virali e i rischi di esposizione e trasmissione tra specie.
Finora, le tecniche di virologia tradizionali (ad esempio, la determinazione del titolo virale attraverso saggi di placca o la stima della dose infettiva della coltura tissutale al 50%) sono state utilizzate per valutare l’infettività IAV nel tempo; ma queste tecniche richiedono molto tempo e richiedono molte forniture10,11,12. Misurare l’impedenza delle cellule infette nel tempo con microelettrodi serve come strumento utile per monitorare la sopravvivenza dello IAV in diverse condizioni ambientali, così come l’inattivazione virale in generale. Questo metodo fornisce dati oggettivi e in tempo reale che sostituiscono l’osservazione umana soggettiva degli effetti citopatici. Può essere utilizzato per determinare la titolazione del virus, sostituendo così le misurazioni tradizionali con intervalli di confidenza più bassi ed evitando test finali ad alta intensità di lavoro.
Esiste una correlazione lineare tra i risultati della titolazione ottenuti mediante misurazione dell’impedenza cellulare e mediante il saggio classico della placca o i metodi TCID50. Pertanto, i dati ottenuti con il metodo di titolazione basato sull’impedenza possono essere facilmente trasformati in valori TCID50 o pfu creando una curva standard con diluizione seriale del virus13,14,15,16,17. Anche il rilevamento, la quantificazione e l’efficacia degli anticorpi neutralizzanti presenti nei campioni di siero possono essere raggiunti utilizzando questo approccio sperimentale18,19. Più recentemente, sono stati utilizzati saggi cellulari basati sull’impedenza per lo screening e la valutazione di composti antivirali contro gli alfaherpesvirus Equid20.
Questa tecnologia è stata utilizzata per valutare la persistenza degli IAV in acqua salina a diverse temperature e per identificare mutazioni nell’emoagglutinina di IAV che aumentano o diminuiscono la persistenza IAV nell’ambiente21. Tale screening richiederebbe un ampio lavoro se si utilizzano metodi di titolazione tradizionali. Tuttavia, questa metodologia può essere utilizzata per qualsiasi virus che abbia un impatto sulla morfologia cellulare, sul numero di cellule e sulla forza di attaccamento della superficie cellulare. Può anche essere utilizzato per monitorare la persistenza in varie condizioni ambientali (ad esempio, nell’aria, nell’acqua o sulle superfici).
Il protocollo qui descritto applica la sopravvivenza IAV in acqua come esempio. I virus dell’influenza umana sono esposti a diversi parametri fisico-chimici durante periodi prolungati. L’acqua salina (35 g/L NaCl) a 35 °C è stata scelta come modello ambientale sulla base dei risultati precedenti9. L’infettività residua dei virus esposti è quantificata in diversi punti temporali attraverso l’infezione cellulare. Le cellule MDCK, il tipo di cellula di riferimento per l’amplificazione IAV, vengono seminate su piastre di microtitolazione a 16 pozzetti rivestite con sensori a microelettrodi e infettate da virus esposti 24 ore dopo. L’impedenza cellulare viene misurata ogni 15 minuti ed espressa come un’unità arbitraria chiamata indice cellulare (CI). Gli effetti citopatici indotti dal virus dell’influenza, il cui tasso di insorgenza dipende direttamente dal numero di particelle virali infettive inoculate nella coltura cellulare, portano alla diminuzione dell’IC, che viene successivamente quantificata come valore CIT50 . Questo valore corrisponde al tempo necessario per misurare una riduzione del 50% dall’IC iniziale (cioè prima dell’aggiunta del virus). I valori CIT50 calcolati per diversi tempi di esposizione ambientale consentono di dedurre la pendenza di inattivazione di un virus dopo la regressione lineare dei valori CIT50 .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA è una tecnologia basata sull’impedenza che viene sempre più utilizzata per il monitoraggio in tempo reale delle proprietà cellulari, come l’aderenza cellulare, la proliferazione, la migrazione e la citotossicità. In questo studio, la capacità di questa tecnologia di valutare la sopravvivenza IAV al di fuori dell’ospite è dimostrata misurando la pendenza dell’inattivazione del virus. Tecniche meticolose come TCID50 e saggi di placca sono sostituite da una valutazione obiettiva in tempo reale della vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
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