Overvåking av influensavirusoverlevelse utenfor verten ved hjelp av sanntidscelleanalyse
Summary
Rapportert her er en protokoll for kvantifisering av smittsomme viruspartikler ved hjelp av sanntidsovervåking av elektrisk impedans av infiserte celler. En praktisk anvendelse av denne metoden presenteres ved å kvantifisere influensa Et virus forfaller under forskjellige fysisk-kjemiske parametere som etterligner miljøforhold.
Abstract
Metoder for viruspartikkel kvantifisering representerer et kritisk aspekt av mange virologistudier. Selv om det finnes flere pålitelige teknikker, er de enten tidkrevende eller ute av stand til å oppdage små variasjoner. Presentert her er en protokoll for presis kvantifisering av viral titer ved å analysere elektriske impedansvariasjoner av infiserte celler i sanntid. Cellulær impedans måles gjennom gullmikroelrode biosensorer som ligger under cellene i mikroplater, hvor størrelsen avhenger av antall celler samt deres størrelse og form. Denne protokollen tillater sanntidsanalyse av celleproliferasjon, levedyktighet, morfologi og migrasjon med forbedret følsomhet. Også gitt er et eksempel på en praktisk anvendelse ved å kvantifisere forfallet av influensa Et virus (IAV) sendt til ulike fysisk-kjemiske parametere som påvirker viral infektivitet over tid (dvs. temperatur, saltholdighet og pH). For slike applikasjoner reduserer protokollen arbeidsmengden som trengs, samtidig som den genererer presise kvantifiseringsdata for smittsomme viruspartikler. Det tillater sammenligning av inaktiveringsbakker blant forskjellige IAV, noe som gjenspeiler deres evne til å vedvare i gitt miljø. Denne protokollen er enkel å utføre, er svært reproduserbar, og kan brukes på ethvert virus som produserer cytopatiske effekter i cellekulturen.
Introduction
Overføringen av et virus er avhengig av kombinasjonen av flere faktorer. For et virus som utskilles i miljøet, avhenger overføringen også av evnen til å vedvare under forhold utenfor verten. Å studere viral inaktivering generelt er derfor et avgjørende skritt for å hjelpe nasjonale helsemyndigheter og beslutningstakere med å iverksette kontroll- og biosikkerhetstiltak.
Kunnskapen om virusvarighet i naturlige og laboratoriemiljøer har økt betydelig det siste tiåret. Når det gjelder influensa A-virus (IAV), sender overføringsrutene deres virale partikler til et bredt spekter av miljøforhold. Spesielt kan de overføres via 1) fekal-orale ruter gjennom vann (dvs. fuglevirus), eller 2) direkte eller indirekte kontakt med forurensede fiender, samt aerosoler og respiratoriske dråper (dvs. fjærfe og pattedyrvirus)1. I alle fall sendes IAV til ulike fysisk-kjemiske parametere (dvs. pH, saltholdighet, temperatur og fuktighet), som mer eller mindre raskt påvirker deres infektivitet2,3,4,5,6,7,8,9. Det er av stor betydning, spesielt når det gjelder zoonotiske og pandemivirus, å vurdere potensialet for miljøfaktorer for å påvirke virusdynamikken og risikoen for eksponering og overføring på tvers av arter.
Så langt har tradisjonelle virologiteknikker (dvs. viral titerbestemmelse gjennom plakkanalyser eller 50% vevskultur smittsom doseestimering) blitt brukt til å vurdere IAV-infektivitet over tid; men disse teknikkene er tidkrevende og krever mange forsyninger10,11,12. Måling av infiserte celler impedans over tid med mikroelektroder fungerer som et nyttig verktøy for å overvåke IAV-overlevelse under forskjellige miljøforhold, samt viral inaktivering generelt. Denne metoden gir objektive sanntidsdata som erstatter subjektiv menneskelig observasjon av cytopatiske effekter. Den kan brukes til å bestemme virustitrering, og dermed erstatte tradisjonelle målinger med lavere konfidensintervaller og unngå arbeidsintensive endepunktanalyser.
Det er en lineær korrelasjon mellom titreringsresultater oppnådd ved måling av celleimpedans og ved klassiske plakkanalyse- eller TCID50-metoder. Derfor kan data oppnådd med impedansbasert titreringsmetode enkelt transformeres i TCID50– eller pfu-verdier ved å skape en standardkurve med seriell fortynning av viruset13,14,15,16,17. Deteksjon, kvantifisering og effekt av nøytraliserende antistoffer tilstede i serumprøver kan også oppnås ved hjelp av denne eksperimentelle tilnærmingen18,19. Mer nylig har impedansbaserte cellulære analyser blitt brukt til å screene og evaluere antivirale forbindelser mot Equid alfaherpesvirus20.
Denne teknologien har blitt brukt til å evaluere utholdenheten til IAVer i saltvann ved forskjellige temperaturer og for å identifisere mutasjoner i hemagglutinin av IAV som øker eller reduserer IAV-utholdenhet i miljøet21. Slik screening vil kreve omfattende arbeid ved bruk av tradisjonelle titreringsmetoder. Denne metodikken kan imidlertid brukes for alle virus som har innvirkning på cellemorfologi, cellenummer og celleoverflatefestestyrke. Den kan også brukes til å overvåke utholdenhet under ulike miljøforhold (dvs. i luften, i vann eller på overflater).
Protokollen beskrevet her gjelder IAV-overlevelse i vann som eksempel. Humane influensavirus blir utsatt for forskjellige fysisk-kjemiske parametere i lengre perioder. Saltvann (35 g/L NaCl) ved 35 °C ble valgt som miljømodell basert på tidligere resultater9. Gjenværende infektivitet av eksponerte virus kvantifiseres på forskjellige tidspunkter gjennom celleinfeksjon. MDCK-celler, referansecelletypen for IAV-forsterkning, er sådd på 16 brønnmikrotiterplater belagt med mikroelektrodesensorer og infisert av eksponerte virus 24 timer senere. Celleimpedans måles hvert 15. Cytopatiske effekter indusert av influensaviruset, hvis utbruddshastighet avhenger direkte av antall smittsomme viruspartikler inokulert til cellekulturen, fører til CI-reduksjon, som senere kvantifiseres som CIT50-verdien . Denne verdien tilsvarer tiden som er nødvendig for å måle en reduksjon på 50 % fra den første KI-en (dvs. før virustilsetning). CIT50-verdier beregnet for flere miljøeksponeringstider tillater fradrag av inaktiveringshellingen av et virus etter lineær regresjon av CIT50-verdier .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA er en impedansbasert teknologi som i økende grad brukes til sanntidsovervåking av celleegenskaper, for eksempel celletilslutning, spredning, migrasjon og cytotoksisitet. I denne studien er kapasiteten til denne teknologien til å vurdere IAV-overlevelse utenfor verten demonstrert ved å måle virusinaktiveringshelling. Raske teknikker som TCID50 og plakkanalyser erstattes av objektiv sanntidsvurdering av celle levedyktighet, og reflekterer dermed cytopatiske effekter indusert av viruset. I likhet med <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
