Monitorando a sobrevivência do vírus da influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real
Summary
Relatado aqui é um protocolo para a quantificação de partículas virais infecciosas usando monitoramento em tempo real da impedância elétrica de células infectadas. Uma aplicação prática deste método é apresentada quantificando a decadência do vírus influenza A sob diferentes parâmetros físico-químicos imitando condições ambientais.
Abstract
Os métodos de quantificação de partículas de vírus representam um aspecto crítico de muitos estudos de virologia. Embora existam várias técnicas confiáveis, elas são demoradas ou incapazes de detectar pequenas variações. Apresentado aqui é um protocolo para a quantificação precisa do titer viral, analisando variações de impedância elétrica de células infectadas em tempo real. A impedância celular é medida através de biosensores de microeletrodos de ouro localizados sob as células em microplacos, nos quais a magnitude depende do número de células, bem como de seu tamanho e forma. Este protocolo permite a análise em tempo real da proliferação celular, viabilidade, morfologia e migração com maior sensibilidade. Também é fornecido um exemplo de uma aplicação prática quantificando a decadência do vírus influenza A (IAV) submetido a vários parâmetros físico-químicos que afetam a infectividade viral ao longo do tempo (ou seja, temperatura, salinidade e pH). Para tais aplicações, o protocolo reduz a carga de trabalho necessária, ao mesmo tempo em que gera dados precisos de quantificação de partículas infecciosas do vírus. Permite a comparação de encostas de inativação entre diferentes IAV, o que reflete sua capacidade de persistir em determinado ambiente. Este protocolo é fácil de executar, é altamente reprodutível, e pode ser aplicado a qualquer vírus que produz efeitos citopáticos na cultura celular.
Introduction
A transmissão de um vírus depende da combinação de vários fatores. Para um vírus secretado no ambiente, sua transmissão também depende da capacidade de persistir em condições fora do hospedeiro. Estudar a inativação viral em geral é, portanto, um passo crucial para ajudar as autoridades nacionais de saúde e os formuladores de políticas a implementar medidas de controle e biossegurança.
O conhecimento sobre a persistência do vírus em ambientes naturais e laboratoriais aumentou consideravelmente na última década. No caso dos vírus influenza A (IAV), suas rotas de transmissão submetem partículas virais a uma ampla gama de condições ambientais. Especificamente, podem ser transmitidas através de 1) rotas fecais-orais através da água (ou seja, vírus aviários), ou 2) contato direto ou indireto por fomitas contaminadas, bem como aerossóis e gotículas respiratórias (ou seja, vírus avícolas e mamíferos)1. De qualquer forma, o IAV é submetido a vários parâmetros físico-químicos (ou seja, pH, salinidade, temperatura e umidade), o que afeta mais ou menos rapidamente sua infectividade2,3,4,5,6,7,8,9. É de grande importância, especialmente no que diz respeito aos vírus zoonóticos e pandemias, avaliar o potencial dos fatores ambientais para afetar a dinâmica do vírus e os riscos de exposição e transmissão de espécies cruzadas.
Até agora, técnicas tradicionais de virologia (ou seja, determinação de titer viral através de ensaios de placa ou 50% de estimativa de dose infecciosa da cultura tecidual) têm sido utilizadas para avaliar a infectividade do IAV ao longo do tempo; mas essas técnicas são demoradas e requerem muitos suprimentos10,11,12. Medir a impedância de células infectadas ao longo do tempo com microeletrodos serve como uma ferramenta útil para monitorar a sobrevivência do IAV em diferentes condições ambientais, bem como a inativação viral em geral. Este método fornece dados objetivos em tempo real que substituem a observação humana subjetiva dos efeitos citopáticos. Pode ser usado para determinar a titulação do vírus, substituindo as medidas tradicionais por intervalos de confiança mais baixos e evitando ensaios de pontos finais intensivos em mão-de-obra.
Existe uma correlação linear entre os resultados de titulação obtidos pela medição da impedância celular e pelos métodos de ensaio de placa clássica ou TCID50. Portanto, os dados obtidos com o método de titulação baseado em impedância podem ser facilmente transformados em valores TCID50 ou pfu, criando uma curva padrão com diluição serial do vírus13,14,15,16,17. A detecção, quantificação e eficácia dos anticorpos neutralizantes presentes em amostras de soro também podem ser alcançadas usando essa abordagem experimental18,19. Mais recentemente, ensaios celulares baseados em impedância têm sido usados para tela e avaliação de compostos antivirais contra equid alphaherpesviruses20.
Esta tecnologia tem sido usada para avaliar a persistência de IAVs em água salina em diferentes temperaturas e identificar mutações na hemaglutina do IAV que aumentam ou diminuem a persistência do IAV no ambiente21. Tal triagem exigiria um trabalho extensivo se utilizasse métodos tradicionais de titulação. No entanto, essa metodologia pode ser usada para qualquer vírus que tenha um impacto na morfologia celular, número celular e força de apego da superfície celular. Também pode ser usado para monitorar a persistência em várias condições ambientais (ou seja, no ar, na água ou em superfícies).
O protocolo aqui descrito aplica a sobrevivência do IAV na água como exemplo. Os vírus da gripe humana são expostos a diferentes parâmetros físico-químicos durante longos períodos. A água salina (35 g/L NaCl) a 35 °C foi escolhida como modelo ambiental com base em resultados anteriores9. A infectividade residual de vírus expostos é quantificada em diferentes momentos através da infecção celular. As células MDCK, o tipo de célula de referência para amplificação do IAV, são semeadas em 16 placas de microtiter bem revestidas com sensores de microeletrodos e infectadas por vírus expostos 24 horas depois. A impedância celular é medida a cada 15 minutos e expressa como uma unidade arbitrária chamada índice celular (IC). Os efeitos citopáticos induzidos pelo vírus da gripe, cuja taxa de início depende diretamente do número de partículas virais infecciosas inoculadas na cultura das células, leva à diminuição da IC, que é posteriormente quantificada como o valor cit50 . Esse valor corresponde ao tempo necessário para medir uma redução de 50% em relação à CI inicial (ou seja, antes da adição do vírus). Os valores CIT50 calculados para vários tempos de exposição ambiental permitem a dedução da inclinação de inativação de um vírus após a regressão linear dos valores cit50 .
Protocol
Representative Results
Discussion
O RTCA é uma tecnologia baseada em impedância que é cada vez mais utilizada para o monitoramento em tempo real de propriedades celulares, como adesão celular, proliferação, migração e citotoxicidade. Neste estudo, a capacidade dessa tecnologia para avaliar a sobrevivência do IAV fora do hospedeiro é demonstrada pela medição da inclinação de inativação do vírus. Técnicas meticulosas como TCID50 e ensaios de placa são substituídas por avaliação objetiva em tempo real da viabilidade celular,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
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