Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real
Summary
Aquí se informa un protocolo para la cuantificación de partículas virales infecciosas utilizando el monitoreo en tiempo real de la impedancia eléctrica de las células infectadas. Una aplicación práctica de este método se presenta mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A bajo diferentes parámetros fisicoquímicos que imitan las condiciones ambientales.
Abstract
Los métodos para la cuantificación de partículas de virus representan un aspecto crítico de muchos estudios de virología. Aunque existen varias técnicas confiables, consumen mucho tiempo o no pueden detectar pequeñas variaciones. Aquí se presenta un protocolo para la cuantificación precisa del título viral mediante el análisis de las variaciones de impedancia eléctrica de las células infectadas en tiempo real. La impedancia celular se mide a través de biosensores de microelectrodos de oro ubicados debajo de las células en microplacas, en los que la magnitud depende del número de células, así como de su tamaño y forma. Este protocolo permite el análisis en tiempo real de la proliferación, viabilidad, morfología y migración celular con mayor sensibilidad. También se proporciona un ejemplo de una aplicación práctica mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A (IAV) sometido a varios parámetros fisicoquímicos que afectan la infectividad viral a lo largo del tiempo (es decir, temperatura, salinidad y pH). Para tales aplicaciones, el protocolo reduce la carga de trabajo necesaria al tiempo que genera datos precisos de cuantificación de partículas de virus infecciosos. Permite la comparación de pendientes de inactivación entre diferentes IAV, lo que refleja su capacidad de persistir en un entorno determinado. Este protocolo es fácil de realizar, es altamente reproducible y se puede aplicar a cualquier virus que produzca efectos citopáticos en cultivo celular.
Introduction
La transmisión de un virus se basa en la combinación de varios factores. Para un virus secretado en el medio ambiente, su transmisión también depende de la capacidad de persistir en condiciones fuera del huésped. El estudio de la inactivación viral en general es, por lo tanto, un paso crucial para ayudar a las autoridades sanitarias nacionales y a los responsables políticos a implementar medidas de control y bioseguridad.
El conocimiento sobre la persistencia del virus en entornos naturales y de laboratorio ha aumentado considerablemente en la última década. En el caso de los virus de la influenza A (IAV), sus rutas de transmisión someten las partículas virales a una amplia gama de condiciones ambientales. Específicamente, pueden transmitirse a través de 1) vías fecal-orales a través del agua (es decir, virus aviares), o 2) contacto directo o indirecto por fómites contaminados, así como aerosoles y gotitas respiratorias (es decir, virus de aves de corral y mamíferos)1. En cualquier caso, los IAV se someten a diversos parámetros fisicoquímicos (es decir, pH, salinidad, temperatura y humedad), que afectan más o menos rápidamente a su infectividad2,3,4,5,6,7,8,9. Es de gran importancia, especialmente en lo que respecta a los virus zoonóticos y pandémicos, evaluar el potencial de los factores ambientales para afectar la dinámica del virus y los riesgos de exposición y transmisión entre especies.
Hasta ahora, las técnicas tradicionales de virología (es decir, la determinación del título viral a través de ensayos de placa o la estimación de la dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50%) se han utilizado para evaluar la infectividad de IAV a lo largo del tiempo; pero estas técnicas requieren mucho tiempo y requieren muchos suministros10,11,12. La medición de la impedancia de las células infectadas a lo largo del tiempo con microelectrodos sirve como una herramienta útil para monitorear la supervivencia de IAV en diferentes condiciones ambientales, así como la inactivación viral en general. Este método proporciona datos objetivos en tiempo real que reemplazan la observación humana subjetiva de los efectos citopáticos. Se puede utilizar para determinar la titulación del virus, reemplazando así las mediciones tradicionales con intervalos de confianza más bajos y evitando los ensayos de punto finales que requieren mucha mano de obra.
Existe una correlación lineal entre los resultados de titulación obtenidos mediante la medición de la impedancia celular y mediante el ensayo clásico de placa o los métodos TCID50. Por lo tanto, los datos obtenidos con el método de titulación basado en impedancia se pueden transformar fácilmente en valores TCID50 o pfu mediante la creación de una curva estándar con dilución en serie del virus13,14,15,16,17. La detección, cuantificación y eficacia de los anticuerpos neutralizantes presentes en muestras de suero también se puede lograr utilizando este enfoque experimental18,19. Más recientemente, se han utilizado ensayos celulares basados en impedancia para detectar y evaluar compuestos antivirales contra equid alfaherpesvirus20.
Esta tecnología se ha utilizado para evaluar la persistencia de IAV en agua salina a diferentes temperaturas y para identificar mutaciones en la hemaglutinina de IAV que aumentan o disminuyen la persistencia de IAV en el medio ambiente21. Dicha detección requeriría un trabajo extenso si se utilizan métodos tradicionales de titulación. Sin embargo, esta metodología se puede utilizar para cualquier virus que tenga un impacto en la morfología celular, el número de células y la fuerza de unión de la superficie celular. También se puede utilizar para controlar la persistencia en diversas condiciones ambientales (es decir, en el aire, en el agua o en superficies).
El protocolo descrito aquí aplica la supervivencia de IAV en el agua como ejemplo. Los virus de la influenza humana están expuestos a diferentes parámetros fisicoquímicos durante períodos prolongados. Se eligió el agua salina (35 g/L NaCl) a 35 °C como modelo ambiental basado en resultados anteriores9. La infectividad residual de los virus expuestos se cuantifica en diferentes puntos de tiempo a través de la infección celular. Las células MDCK, el tipo de célula de referencia para la amplificación de IAV, se siembran en placas de microtitulación de 16 pocillos recubiertas con sensores de microelectrodos e infectadas por virus expuestos 24 h después. La impedancia celular se mide cada 15 minutos y se expresa como una unidad arbitraria llamada índice celular (IC). Los efectos citopáticos inducidos por el virus de la gripe, cuya tasa de aparición depende directamente del número de partículas virales infecciosas inoculadas al cultivo celular, conduce a la disminución del IC, que posteriormente se cuantifica como el valor CIT50 . Este valor corresponde al tiempo necesario para medir una reducción del 50% desde el IC inicial (es decir, antes de la adición del virus). Los valores de CIT50 calculados para varios tiempos de exposición ambiental permiten deducir la pendiente de inactivación de un virus después de la regresión lineal de los valores de CIT50 .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA es una tecnología basada en la impedancia que se utiliza cada vez más para el monitoreo en tiempo real de las propiedades celulares, como la adherencia celular, la proliferación, la migración y la citotoxicidad. En este estudio, la capacidad de esta tecnología para evaluar la supervivencia del IAV fuera del huésped se demuestra midiendo la pendiente de inactivación del virus. Las técnicas fastidiosas como TCID50 y los ensayos de placa se sustituyen por una evaluación objetiva en tiempo real de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
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