Orm-align / Worm_CP er en enkel FIJI / CellProfiler arbeidsflyt som kan brukes til å rette og justere Caenorhabditis elegans prøver og å score helorm bildebaserte analyser uten behov for tidligere opplæringstrinn. Vi har brukt Worm-align/Worm_CP på kvantifisering av varmesjokkindusert uttrykk hos levende dyr eller lipiddråper i faste prøver.
Et problem som ofte oppstår når du anskaffer bildedata fra faste eller bedøvede C. elegans er at ormer krysser og klynger seg med sine naboer. Dette problemet forverres med økende tetthet av ormer og skaper utfordringer for avbildning og kvantifisering. Vi utviklet en FIJI-basert arbeidsflyt, Worm-align, som kan brukes til å generere enkelt- eller flerkanals montasjer av brukervalgte, rettede og justerte ormer fra rå bildedata av C. elegans. Orm-align er en enkel og brukervennlig arbeidsflyt som ikke krever tidligere opplæring av brukeren eller analysealgoritmen. Montasjer generert med Worm-align kan hjelpe visuell inspeksjon av ormer, deres klassifisering og representasjon. I tillegg kan utgangen av Worm-align brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre programvareplattformer for bildeanalyse. Vi demonstrerer dette ved å importere Worm-align-utgangen til Worm_CP, et datasamlebånd som bruker Open-source CellProfiler-programvaren. CellProfilers fleksibilitet gjør det mulig å innlemme flere moduler for screening av høyt innhold. Som et praktisk eksempel har vi brukt rørledningen på to datasett: det første datasettet er bilder av varmesjokkreporterormer som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av arrangøren av et varmesjokkinduserbart gen hsp-70, og det andre datasettet er bilder hentet fra faste ormer, farget for fettbutikker med fluorescerende fargestoff.
En relativt enkel organisme, nematoden C. elegans, er et ekstremt nyttig modellsystem for å studere menneskelige sykdommer. Omtrent 38% av genene i C. elegans genom har funksjonelle kolleger hos mennesker1,2. En av de unike egenskapene til C. elegans er at den er optisk gjennomsiktig, noe som gir enkel tilgang til in vivo-informasjon om (sub) cellulært uttrykk for fluorescerende journalister på tvers av vev. Dette gjør C. elegans en førsteklasses modell organisme for høyinnholdsskjermer ved hjelp av bildebaserte plattformer3. Men et problem som ofte kompliserer disse studiene er at når de avbilder tette populasjoner av ormer, har de en tendens til å krysse og klynge, noe som gjør sammenligninger på tvers av individuelle ormer utfordrende, overskyet nedstrøms bildeanalyse og kvantisering.
Eksisterende løsninger som overvinner dette problemet, er vanligvis avhengige av optimalisering av kulterings- og bildeprotokollen, for eksempel gjennom bruk av mikroflytoppsett4, slik at enkeltormer kan fanges i separate bilder5,6. Andre har brukt maskinlæringsalgoritmer som åpner for anerkjennelse av enkeltormer, selv i en klumpete befolkning. Et utmerket eksempel på sistnevnte er WormToolbox, som er en modulær forlengelse av åpen kildekode bildeanalyseplattform, CellProfiler7. WormToolbox tilbyr en løsning med høy gjennomstrømning og høyt innhold for analyse av C. elegans,og drar helt klart nytte av inkluderingen i CellProfiler, da ytterligere analysemoduler enkelt kan inkluderes. Selv om WormToolbox leveres med en forhåndstrent modell (DefaultWormModel.xml), er omskolering av maskinlæringsalgoritmen vanligvis nødvendig for hvert nytt program. Online tutorials om hvordan du gjør dette er tilgjengelig på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Til tross for dette krever installasjon og bruk av WormToolbox en betydelig tidsinvestering for nybegynnere.
Her beskriver vi en enkel og kostnadseffektiv protokoll til kultur, og bildepopulasjoner av C. elegans. For å tillate vurdering av individuelle ormer i de oppkjøpte bildene har vi utviklet en enkel åpen kildekode FIJI-basert arbeidsflyt, kalt Worm-align. Orm-align kan brukes til å generere enkelt- eller flerkanals montasjer av rettede og justerte ormer. For det første må brukeren manuelt velge individuelle ormer for analyse ved å tegne en linje fra hodet til halen. Orm-align vil bruke dette valget til å beskjære utvalgte ormer fra oversiktsbildet, og generere en montasje der valgte ormer er rettet og justert for å lette visuell sammenligning og presentasjon.
I tillegg kan utgangen av Worm-align brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre programvareplattformer for bildeanalyse. Vi demonstrerer dette ved å importere Worm-align-utgangen til Worm_CP, et datasamlebånd som bruker Open-source CellProfiler-programvaren. CellProfilers fleksibilitet gjør det mulig å innlemme flere moduler for screening av høyt innhold. Vi har brukt Worm_CP rørledningen til å kvantifisere varmesjokkresponsen, en godt bevart beskyttelsesmekanisme som binder seg over proteiner som er feilfoldet på grunn av stressfaktorer som høy temperatur8. Spesielt brukte vi rørledningen på ormer som bærer en integrert multi-kopi transgene, hvor arrangøren av et varmesjokk induserbart gen, hsp-70 (C12C8.1), driver grønt fluorescerende protein (GFP)9. Vi har også brukt Worm_CP rørledningen på faste dyr som har blitt merket med et fluorescerende fargestoff som visualiserer lipiddråper (LDer), den viktigste fettlagringsorganelle i C. elegans10. Selv om denne arbeidsflyten ikke har gjennomstrømningen som tilbys av WormToolBox, er det et brukervennlig og enkelt alternativ for visuell presentasjon og analyse av bildebaserte C. elegans eksperimenter.
Orm-align er en FIJI-basert bildebehandlingsrørledning som lett genererer montasjer av brukervalgte ormer, der ormer rettes og justeres for å hjelpe visuell sammenligning, klassifisering og representasjon. Selv om denne funksjonen også tilbys av noen eksisterende verktøy, spesielt WormToolbox-modulen i CellProfiler7, krever Worm-align relativt lite tidligere bildeanalyseopplevelse: Brukere trenger bare å spore de ormene de ønsker å velge for montasjen (og analysen). Selv om sporing av ormene på råbildedataene er en enkel prosess – spesielt når en berøringsskjermdatamaskin eller nettbrett er tilgjengelig- det er viktig, at linjer tegnes riktig langs ormenes langsgående akse. Ufullstendige linjer, som bare følger en del av ormen, vil resultere i delvise ormer i montasjen (det vil si ormer som mangler hoder av haleender) og delvissegmenteringsmasker under CellProfiler-analyse. Også, hvis linjer fra to individuelle ormer krysser, vil ormene ikke bli riktig behandlet i ormen justering montasje samt for fluorescens kvantifisering. For kvalitetskontroll lagres et overleggsbilde av linjevalgene på det opprinnelige bildet i datamappen, sammen med en QC-tabell. Fra disse kan problematiske linjer som fører til feil segmenterte ormer lett identifiseres og utelates fra montasje og/eller påfølgende analyse.
Selv om direkte innspill fra eksperimentereren i valg av ormer kanskje virker litt tidkrevende, presenterer det en klar fordel av arbeidsflyten over andre i eksperimenter der ormer fra forskjellige utviklingsstadier er tilstede i samme bilde: Ormer kan velges under “sporingstrinn”, ved å skissere bare de ormene som er i riktig utviklingsstadium. Alternativt kan ormer filtreres ved hjelp av utgangen fra Worm_CP basert på enten lengden på sporingslinjen, eller området av segmenteringsmasken, både pålitelige indikatorer på ormenes lengde/størrelse. Uten tvil kan maskinlæringsalgoritmer slite med å gjenkjenne ormer fra forskjellige utviklingsstadier, da deres størrelse og utseende i DIC-bildene er så forskjellige.
Utgangen av Worm-align kan brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre bildeanalyseprogramvareplattformer. Vi demonstrerte dette ved å importere Worm-align-utgangen til en enkel CellProfiler-rørledning (Worm_CP), som gjør det mulig å kvantifisere flerkanals fluorescensintensitet i de individuelle ormene som ble valgt mens du kjører Worm-align-rørledningen. Vi valgte denne tilnærmingen på grunn av fleksibiliteten til CellProfiler-programvaren: Det er enkelt å innlemme flere moduler i rørledningen for å analysere flere funksjoner i individuelle ormer (f.eks. måle størrelsen på lipiddråper, eller stressgranulat, kjerner, mitokondrier). I tillegg kan enkeltormmaskene potensielt brukes til å trene en ny modell for WormToolbox7.
De viktigste fordelene med denne metoden er at den er rask og krever et enkelt ormmonterings oppsett. Denne metoden er raskere da den ikke krever å bruke tid på å lære programvaredrift eller kjøre opplæringssett gjennom enmaskinalgoritme 7. Videre fungerer denne metoden med enten levende eller faste ormer bare montert på vanlige agarose pads. Det er ikke nødvendig å bruke komplekse mikrofluidiske kamre, som utviklet i andre metoder5,6.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr Christian Lanctôt ved BIOCEV (Praha, Tsjekkia) for å lære oss munnen mikropipette teknikk for å montere faste ormer og Dr Fatima Santos og Dr Debbie Drage for å dele sikkerhetsoppsett på munnen mikropipette. Vi takker også Francesca Hodge for redigering av manuskriptet, Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. OC støttes av ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Beaker | |||
BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
Conical flask | |||
Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Isopropanol | |||
Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microwave Oven | Delongi | ||
M9 | prepared in the lab according to15 | ||
9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
PBS | prepared in the lab | ||
Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Rotator | Stuart Scientific | ||
Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |