Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)
Summary
L’ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l’analisi della spettrometria di massa per identificare l’ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.
Abstract
Studiare la struttura e la dinamica dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l’instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Il modo in cui la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l’identità del centromero) sono determinate e partecipano alla segregazione accurata del cromosoma è una questione fondamentale. Il CENP-A è proposto come l’indicatore non-DNA (segno epigenetico) dell’identità del centromero, e l’ubiquililazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A al centromero, ereditata dalla dimerizzazione tra divisione cellulare e indispensabile alla vitalità cellulare.
Qui descriviamo l’analisi della spettrometria di massa per identificare l’ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che l’ubiquilazione in una lisina diversa è indotta a causa dell’etichettatura EYFP nella proteina mutante CENP-A K124R. L’ubiquilità di lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R è stata identificata con successo, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l’analisi della spettrometria di massa. Un avvertimento è discusso nell’uso di GFP/EYFP o l’etichettatura di proteine ad alto peso molecolare come strumento per analizzare la funzione di una proteina. L’attuale limite tecnico è discusso anche per l’individuazione di bande oniquilate, l’identificazione di ubiquilazione site-specific, e la visualizzazione dell’ubiquilazione nelle cellule viventi o una singola cellula specifica durante l’intero ciclo cellulare.
Il metodo di analisi della spettrometria di massa qui presentato può essere applicato alla proteina umana CENP-A con diversi tag e altre proteine del centromere-kinetochore. Questi metodi combinatori costituiti da diversi saggi / analisi potrebbero essere raccomandati per i ricercatori che sono interessati a identificare i ruoli funzionali dell’ubiquilazione.
Introduction
Nella maggior parte degli eucarioti, i microtubuli del mandrino devono essere attaccati a una singola regione di ogni cromosoma, definito centromero. Il cinetochore è un complesso di proteine che si trovano al centromero. Lo studio dei tempi dei movimenti della proteina centromera e cinetochore e la struttura dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l’instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Le domande chiave sono come vengono determinate la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l’identità del centromero) e come partecipano alla segregazione cromosomica accurata. Nella maggior parte delle specie, la presenza di un nucleomatoma speciale contenente una proteina simile a un istone specifica chiamata CENP-A definisce l’identità del centromero. Pertanto, si propone che il CENP-A sia l’indicatore non DNA (segno epigenetico) dell’identità del centromero. È importante chiarire il meccanismo di come CENP-A definisce l’identità del centromero negli esseri umani.
La proteina di riconoscimento della giunzione di Holliday (HJURP) è l’accompagnatore specifico CENP-A che deposita CENP-A nei nucleosomeri centromerici1,2,3. Abbiamo già riferito che il CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase è richiesto per l’ubiquilazione CENP-A sulla lisina 124 (K124) e la localizzazione del centromero4. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che il reclutamento di centrimeri di CENP-A di5nuova sintesi richiede CENP-A oniquizzato preesistente. Così, è stato fornito un modello che suggerisce che l’ubiquilinazione CENP-A viene ereditata attraverso la dimerizzazione tra le divisioni cellulari.
In contrasto con le nostre scoperte e quelle di Yu et al., risultati negativi per quanto riguarda il CENP-A e la sua localizzazione centromerica sono stati recentemente pubblicati6. L’articolo affermava che le modifiche del CENP-A sulla lisina 124 (K124) sono dispensabili per l’istituzione, la manutenzione e la funzione a lungo termine dei centrimeri umani, sulla base dei loro risultati negativi che mostravano che la mutazione di K124R non influenzava la localizzazione del centromero CENP-A né la vitalità cellulare6. Tuttavia, c’è abbastanza spazio per discutere nei loro risultati e conclusioni, e abbiamo già descritto quale problema ci potrebbe essere nella loro precedente pubblicazione7. Occorre prestare attenzione al fatto che fondessero le proteine con il CENP-A, che hanno pesi molecolari molto più grandi delle dimensioni del CENP-A endogeno: ad esempio, hanno fuso la proteina fluorescente gialla avanzata da 30 kDa (EYFP) a 16 kDa CE-A e hanno analizzato la fusione delle proteine EYFP-CENP-A K124R nel loro sistema RPE-1CE-A-Knockout.-/F L’ubiquitina K124 non dovrebbe legarsi direttamente all’HJURP sulla base di previsioni strutturali4, tuttavia si prevede che l’aggiunta di monoubiquitina avrà un impatto sulla conformazione proteica del CENP-A. La proteina della conformazione CENP-A può essere modificata dalla presenza di una grande proteina di fusione, e questo cambiamento conformazionale può mascherare i cambiamenti strutturali causati dalla perdita di ubiquilazione. Suggeriamo che la fusione di proteine di grandi dimensioni induca l’ubiquililazione in una lisina diversa da K124 nel mutante EYFP-CENP-A K124R e questa ubiquililazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante. La prova che l’ubiquilazione si verifica in lisina diversa nella proteina mutante CENP-A K124R con una grande proteina tag (EYFP) è stata riportata nella nostra precedente pubblicazione8. Si è scoperto che il tagging EYFP induce l’ubiquitinazione di un altro sito lisina di EYFP-CENP-A K124R e che EYFP-CENP-A K124R mutante lega a HJURP. Di conseguenza, questa ubiquilazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante, e sia EYFP-CENP-A WT che K124R mutanti hanno mostrato la localizzazione del centromero (abbiamo usato e confrontato pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutante, insieme al controllo pBabe-EFP). I risultati hanno dimostrato che i mutanti CENP-A K124R marcati con bandiera sono letali, ma possono essere salvati da una fusione monoubiquitina, suggerendo che l’ubiquilazione CENP-A è indispensabile per la vitalità cellulare.
Negli ultimi anni, molti studi hanno sviluppato diversi saggi per identificare le modifiche post-traduzionali (PTM) della proteina CENP-A e di altre proteine centromere-cinetochore sia in vivo che in vitro9,10,11. Analogo ai PTM delle proteine istone che sono un importante meccanismo che regola la funzione della cromatina, i PTM dei componenti della cromatina centromerici sono anche coinvolti in un meccanismo essenziale per regolare la struttura complessiva e la funzione dei centrimeri. La maggior parte dei siti CENP-A PTM sono specifici dei nucleosomi che contengono CENP-A, anche se alcuni di essi sono conservati nell’istone H3, suggerendo che la modifica di questi residui contribuisce alla funzione specifica del centromero. I PTM del CENP-A, tra cui il fosfororylazione, l’acetilazione, la metilazione e l’ubiquilazione sono stati precedentemente segnalati9, suggerendo che il CENP-A è sottoposto a una varietà di PTM e dei loro array combinatori sul suo dominio aminofileterminus e C-terminus histone-fold. L’importanza delle modifiche CENP-A in più funzioni è stata rivelata da molti gruppi, tra cui la nostra. Queste funzioni comportano la deposizione CENP-A ai centrimeri, la stabilità delle proteine e il reclutamento del CCAN (rete costitutiva associata a centrimere)9. Tuttavia, studi limitati e risultati dei PTM CENP-A sono preformati quando si fanno confronti con uno degli istoni canonici che regolano direttamente o indirettamente la loro funzione. Anche le relazioni tecniche che si concentrano sulla metodologia per identificare questi PTM CENP-A sono limitate.
Poiché l’ubiquilazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A alcentromero 12, ereditata dalla dimerizzazione tra la divisione cellulare5e indispensabile alla vitalità cellulare8, il metodo per identificare l’ubiquilazione CENP-A sarebbe essenziale in futuro per studiare l’attività funzionale, il posizionamento e la struttura del centromero. Pertanto, qui descriviamo l’analisi della spettrometria di massa per identificare l’ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l’ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. I protocolli di altri saggi e analisi di controllo (analisi dell’immunofluorescenza, analisi della crescita della colonia e analisi dell’ubiquilazione in vivo) sono anche presentati per discutere correttamente l’esito di un’analisi della spettrometria di massa maggiore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto i metodi di analisi della spettrometria di massa per identificare l’ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l’ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. Nei nostri risultati, abbiamo identificato con successo l’ubiquilazione sulla lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l’analisi della spettrometria di massa. L’analisi della spettrometria di mass…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Chao-Jun Li presso il Model Animal Research Center della Nanjing University per l’analisi della spettrometria di massa. Ringraziamo Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e gli attuali ricercatori del Model Animal Research Center, della Nanjing University e del Greehey Children’s Cancer Research Institute per la loro utile discussione, guida sperimentale e reagenti. Ringraziamo Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler per i loro generosi doni di reagenti. Y.N. è stato sostenuto dal Fondo di costruzione della provincia di Jiangsu ”Doppia-Prima Classe”, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Provincia di Jiangsu 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Provincia “Foreign Expert Hundred Talents Program” Fund (SBK2019010048) e National Natural Science Foundation in Cina (31970665). Questo studio è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione NCI R21 CA205659.
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
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