Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)
Summary
La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.
Abstract
El estudio de la estructura y la dinámica de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. La forma en que se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y participan en la segregación cromosómica precisa es una cuestión fundamental. Se propone que CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere, y se requiere la ubicuación CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular.
Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que la ubicuidad en una lisina diferente se induce debido al etiquetado EYFP en la proteína mutante CENP-A K124R. Se identificó con éxito la ubiquilación de lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en el ANálisis de espectrometría de masas CENP-A. Una advertencia se discute en el uso de GFP/EYFP o el etiquetado de proteína de alto peso molecular como herramienta para analizar la función de una proteína. También se discute el límite técnico actual para la detección de bandas ubiquitidas, la identificación de la ubiculación específica del sitio y la visualización de la ubicuidad en células vivas o una sola célula específica durante todo el ciclo celular.
El método de análisis de espectrometría de masas presentado aquí se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes etiquetas y otras proteínas centromere-kinetochore. Estos métodos combinatorios que consisten en varios ensayos/análisis podrían recomendarse a los investigadores que estén interesados en identificar funciones funcionales de ubiculación.
Introduction
En la mayoría de los eucariotas, los microtúbulos del husillo deben adherirse a una sola región de cada cromosoma, llamado centromere. El kinetochore es un complejo de proteínas que se encuentran en el centromere. Estudiar el momento de los movimientos de la proteína centromere y kinetochore y la estructura de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. Las preguntas clave son cómo se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y cómo participan en la segregación cromosómica precisa. En la mayoría de las especies, la presencia de un nucleosoma especial que contiene una proteína específica similar a la histona llamada CENP-A define la identidad centromere. Por lo tanto, se propone que el CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere. Es importante dilucidar el mecanismo de cómo CENP-A define la identidad centromere en los seres humanos.
La proteína de reconocimiento de unión Holliday (HJURP) es el chaperon específico de CENP-A que deposita CENP-A en nucleosomas centroméricos1,,2,,3. Hemos informado previamente que la ligasa CUL4A-RBX1-COPS8 E3 es necesaria para la ubiculación CENP-A en la lisina 124 (K124) y la localización de centromere4. Además, nuestros resultados mostraron que el reclutamiento de centromere de CENP-A recién sintetizado requiere una ubicuidad preexistente CENP-A5. Por lo tanto, se proporcionó un modelo que sugiere que la ubicuidad CENP-A se hereda a través de la dimerización entre divisiones celulares.
En contraste con nuestros hallazgos y los de Yu et al., los resultados negativos sobre el CENP-A y su localización centromérica se publicaron recientemente6. El artículo afirmaba que las modificaciones CENP-A en la lisina 124 (K124) son prescindibles para el establecimiento, mantenimiento y función a largo plazo de los centromeres humanos, basándose en sus resultados negativos que demuestran que la mutación de K124R no afectó a la localización del centromere CENP-A ni la viabilidad celular6. Sin embargo, hay suficiente margen para el debate en sus resultados y conclusiones, y ya hemos descrito qué problema podría haber en su publicación anterior7. Se debe prestar atención a que fusionaron proteínas con CENP-A, que tienen pesos moleculares mucho mayores que el tamaño de CENP-A endógeno: por ejemplo, fusionaron la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) de 30 kDa a 16 kDa CENP-A y analizaron la proteína de fusión EYFP-CENP-A K124R en su sistema RPE-1 CENP-A-/F knockout. No se espera que la ubiquitina K124 se una directamente al HJURP sobre la base de las predicciones estructurales4,sin embargo, se prevé que la adición de monoubiquitina tenga un impacto en la conformación proteica de CENP-A. La proteína de la conformación CENP-A puede ser cambiada por la presencia de una gran proteína de fusión, y este cambio conformacional puede enmascarar los cambios estructurales causados por la pérdida de ubiculación. Sugerimos que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de la K124 en el mutante EYFP-CENP-A K124R y esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único original K124R. La evidencia de que la ubicuidad ocurre en diferentes lisina en la proteína mutante CENP-A K124R con una proteína de etiqueta grande (EYFP) fue reportada en nuestra publicación anterior8. Se encontró que el etiquetado EYFP induce la ubiquitinación de otro sitio de lisina de EYFP-CENP-A K124R y que el mutante EYFP-CENP-A K124R se une a HJURP. Como resultado, esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único K124R original, y tanto los mutantes EYFP-CENP-A WT como K124R mostraron localización de centromere (usamos y comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT y mutante K124R, junto con el control pBabe-EYFP.). Los resultados demostraron que los mutantes CENP-A K124R con etiqueta de bandera o sin etiquetar son letales, pero pueden ser rescatados por una fusión monoubiquitina, lo que sugiere que la ubicuidad CENP-A es indispensable para la viabilidad celular.
En los últimos años, muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos para identificar las modificaciones posttranslacionales (PTM) de la proteína CENP-A y otras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo como in vitro9,,10,,11. Análogos a los PTM de las proteínas histonas que son un mecanismo importante que regula la función de la cromatina, los PTM de los componentes centroméricos de cromatina también participan en un mecanismo esencial para regular la estructura general y la función de los centromeros. La mayoría de los sitios CENP-A PTM son específicos de los nucleosomas que contienen CENP-A, aunque algunos de ellos se conservan en la histona H3, lo que sugiere que la modificación de estos residuos contribuye a la función específica del centromere. Las PTM de CENP-A, incluyendo la fosforilación, la acetilación, la metilación y la ubicuidad, se notificaron previamente9, lo que sugiere que CENP-A está sujeta a una variedad de TPM y sus matrices combinatorias en su dominio amino terminus y C-terminus histone-fold. La importancia de las modificaciones CENP-A en múltiples funciones fue revelada por muchos grupos, incluyendo el nuestro. Estas funciones implican la deposición CENP-A en los centromeres, la estabilidad proteica y el reclutamiento de la CCAN (red asociada al centromere constitutivo)9. Sin embargo, los estudios y hallazgos limitados de las PTM CENP-A se preforman cuando se realizan comparaciones con una de las histonas canónicas que regulan directa o indirectamente su función. Los informes técnicos centrados en la metodología para identificar estos PTM CENP-A también son limitados.
Debido a que se requiere la ubicuidad CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere12,heredada a través de la dimerización entre la división celular5,e indispensable para la viabilidad celular8, el método para identificar la ubiculación CENP-A sería esencial en el futuro para estudiar la actividad funcional, el posicionamiento y la estructura del centromere. Por lo tanto, aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. También se presentan protocolos de otros ensayos y análisis de control (análisis de inmunofluorescencia, ensayo de crecimiento de colonias y ensayo de ubicuidad in vivo) para discutir el resultado del análisis de espectrometría de masas importante correctamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos métodos de análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. En nuestros resultados, identificamos con éxito la ubiculación en lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A a través del análisis de espectrometría de masas. El análisis de espectrometría de masas de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Chao-Jun Li en el Model Animal Research Center de la Universidad de Nanjing por el análisis de espectrometría de masas. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa y a los investigadores actuales del Model Animal Research Center, Nanjing University y Greehey Children’s Cancer Research Institute por su útil discusión, orientación experimental y reactivos. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago y Dawn S. Chandler por sus generosos dones de reactivos. Y.N. con el apoyo fue apoyado por el Fondo de Construcción de la Provincia de Jiangsu ”Doble- Primera Clase”, Fondo de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (SBK2019021248), Fondo deSeis Picos de Talento Grande de la Provincia de Jiangsu (TD-SWYY-001), Fondo “Programa de Expertos Cien Talentos” de la Provincia de Jiangsu (SBK2019010048) y National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudio fue apoyado en parte por la subvención NCI R21 CA205659.
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
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