Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)
Summary
CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.
Abstract
Die Untersuchung der Struktur und Dynamik von Kinetochoren und Zentromern ist wichtig für das Verständnis der chromosomalen Instabilität (CIN) und der Krebsprogression. Wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimeros (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt werden und an einer genauen Chromosomensegregation beteiligt sind, ist eine grundlegende Frage. CENP-A wird als Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Simerung) der Zentromeridentität vorgeschlagen, und CENP-A-Ubiquitylierung ist für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer erforderlich, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist.
Hier beschreiben wir die Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass die Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin aufgrund der EYFP-Tagging im CENP-A K124R mutierten Protein induziert wird. Lysin 306 (K306) Ubiquitylierung in EYFP-CENP-A K124R wurde erfolgreich identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Ein Vorbehalt wird bei der Verwendung von GFP/EYFP oder der Kennzeichnung von hochmolekularem Protein als Werkzeug zur Analyse der Funktion eines Proteins diskutiert. Aktuelle technische Grenzwerte werden auch für den Nachweis von ubiquitylierten Bändern, die Identifizierung von standortspezifischer Ubiquitylierung(n) und die Visualisierung der Ubiquitylierung in lebenden Zellen oder einer bestimmten Einzelzelle während des gesamten Zellzyklus diskutiert.
Die hier vorgestellte Methode der Massenspektrometrieanalyse kann auf humanes CENP-A-Protein mit verschiedenen Tags und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen angewendet werden. Diese kombinatorischen Methoden, die aus mehreren Assays/Analysen bestehen, könnten Forschern empfohlen werden, die daran interessiert sind, funktionelle Rollen der Ubiquitylierung zu identifizieren.
Introduction
In den meisten Eukaryoten müssen Spindelmikrotubuli an einer einzigen Region jedes Chromosoms, die als Zentromer bezeichnet wird, befestigt werden. Der Kinetochor ist ein Komplex von Proteinen, die sich am Zentromer befinden. Die Untersuchung des Timings der Bewegungen von Zentromer und Kinetochorei und der Struktur von Kinetochoren und Zentromeren ist wichtig für das Verständnis der Chromosomeninstabilität (CIN) und der Krebsprogression. Die wichtigsten Fragen sind, wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimers (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt wird und wie sie an der genauen Chromosomensegregation beteiligt sind. Bei den meisten Arten definiert das Vorhandensein eines speziellen Nukleosoms, das ein spezifisches Histon-ähnliches Protein namens CENP-A enthält, die Zentromeridentität. Daher wird vorgeschlagen, dass CENP-A der Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Markierung) der Zentrimeridentität ist. Es ist wichtig, den Mechanismus zu klären, wie CENP-A die Zentromeridentität beim Menschen definiert.
Das Holliday Junction Recognition Protein (HJURP) ist der CENP-A-spezifische Chaperon, der CENP-A in zentromere Nukleosomen1,2,3ablagert. Wir haben bereits berichtet, dass die CUL4A-RBX1-COPS8 E3 Ligase für die CENP-A-Ubiquitylierung auf Lysin 124 (K124) und Zentromerlokalisierung4erforderlich ist. Außerdem zeigten unsere Ergebnisse, dass die Zentromerrekrutierung von neu synthetisiertem CENP-A bereits bestehende, ubiquitylierte CENP-A5erfordert. So wurde ein Modell zur Verfügung gestellt, das darauf hindeutet, dass die CENP-A-Ubiquitylierung durch Dimerisierung zwischen Zellteilungen vererbt wird.
Im Gegensatz zu unseren Erkenntnissen und denen von Yu et al. wurden kürzlich negative Ergebnisse in Bezug auf das CENP-A und seine zentromere Lokalisierung veröffentlicht6. Der Artikel behauptete, dass CENP-A-Modifikationen an Lysin 124 (K124) für die Etablierung, Wartung und Langzeitfunktion menschlicher Zentromere entbehrlich sind, basierend auf ihren negativen Ergebnissen, die zeigen, dass die Mutation von K124R weder die CENP-A-Zentromer-Lokalisierungnoch dieZelllebensfähigkeit beeinflusst eklaten. In ihren Ergebnissen und Schlussfolgerungen gibt es jedoch genügend Raum für Debatten, und wir haben bereits in ihrer vorherigen Veröffentlichung7beschrieben, welches Problem es geben könnte. Es sollte darauf geachtet werden, dass sie Proteine mit CENP-A verschmolzen, die viel größere Molekulargewichte haben als die Größe des endogenen CENP-A: Z.B. verschmolzen sie 30 kDa verbessertes gelbes Fluoreszenzprotein (EYFP) zu 16 kDa CENP-A und analysierte EYFP-CENP-A K124R-Fusionsprotein in ihrem RPE-1 CENP-A-/F-Knockout-System.-/F Es wird nicht erwartet, dass K124-Ubiquitin direkt an HJURP auf der Grundlage struktureller Vorhersagen4bindet, jedoch wird die Zugabe von Mono-Ubiquitin einen Einfluss auf die Proteinkonformation von CENP-A haben. Das Protein der CENP-A-Konformation kann durch das Vorhandensein eines großen Fusionsproteins verändert werden, und diese Konformationsänderung kann die strukturellen Veränderungen verschleiern, die durch den Verlust der Ubiquitylierung verursacht werden. Wir schlagen vor, dass die Fusion von großformatigem Protein eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124 in EYFP-CENP-A K124R Mutant induziert und diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp hemmt/maskiert. Beweise dafür, dass Ubiquitylierung bei unterschiedlichem Lysin im CENP-A K124R-Mutantenprotein mit einem großen Tag-Protein (EYFP) auftritt, wurde in unserer vorherigen Publikation8berichtet. Es wurde festgestellt, dass EYFP-Tagging eine Ubiquitination einer anderen Lysin-Site von EYFP-CENP-A K124R induziert und dass EYFP-CENP-A K124R Mutant an HJURP bindet. Infolgedessen hemmt/maskiert diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp, und sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R-Mutationzeigten zeigten zentrominische Lokalisation (wir verwendeten und verglichen pBabe-EYFP-CENP-A WT und K124R Mutant, zusammen mit pBabe-EYFP-Steuerung). Die Ergebnisse zeigten, dass mit Flaggen markierte oder nicht markierte CENP-A K124R-Mutationen tödlich sind, aber durch eine Monoubiquitin-Fusion gerettet werden können, was darauf hindeutet, dass Die CENP-A-Ubiquitylierung für die Zelllebensfähigkeit unerlässlich ist.
In den letzten Jahren haben viele Studien verschiedene Assays entwickelt, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) von CENP-A-Proteinen und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen sowohl in vivo als auch in vitro9,10,11zu identifizieren. Analog zu den PTMs von Histonproteinen, die ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung der Funktion von Chromatin sind, sind PTMs von zentromerem Chromatin-Komponenten auch an einem wesentlichen Mechanismus zur Regulierung der Gesamtstruktur und Funktion von Zentromeren beteiligt. Die meisten CENP-A PTM-Standorte sind spezifisch für CENP-A-haltige Nukleosomen, obwohl einige von ihnen in Histon H3 konserviert werden, was darauf hindeutet, dass eine Modifikation dieser Rückstände zur zentrominspezifischen Funktion beiträgt. PTMs von CENP-A einschließlich Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung und Ubiquitylierung wurden zuvor9berichtet, was darauf hindeutet, dass CENP-A einer Vielzahl von PTMs und ihren kombinatorischen Arrays auf seiner Amino-Terminus- und C-Terminus-Histon-Domäne unterworfen ist. Die Bedeutung von CENP-A Modifikationen in mehreren Funktionen wurde von vielen Gruppen, einschließlich unserer, deutlich. Diese Funktionen umfassen CENP-A-Ablagerungen an Zentromeren, Proteinstabilität und Rekrutierung des CCAN (konstitutives Zentromer-assoziiertes Netzwerk)9. Allerdings werden begrenzte Studien und Ergebnisse von CENP-A PTMs vorgeformt, wenn Vergleiche mit einem kanonischen Histon enden, die ihre Funktion direkt oder indirekt regulieren. Technische Berichte, die sich auf die Methodik zur Identifizierung dieser CENP-A-PTMs konzentrieren, sind ebenfalls begrenzt.
Da CENP-A-Ubiquitylierung für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer12erforderlich ist, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung5vererbt wird und für die Zelllebensfähigkeit8unverzichtbar ist, wäre die Methode zur Identifizierung der CENP-A-Ubiquitylierung in Zukunft unerlässlich, um die funktionelle Aktivität, Positionierung und Struktur des Zentromers zu untersuchen. Daher beschreiben wir hier die Massenspektrometrieanalyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. Protokolle anderer Kontrolltests und -analysen (Immunfluoreszenzanalyse, Kolonie-Auswuchs-Assay und In-vivo-Ubiquitylierungstest) werden ebenfalls vorgestellt, um die Ergebnisse der großen Massenspektrometrie-Analyse richtig zu diskutieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben wir Methoden der Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. In unseren Ergebnissen haben wir erfolgreich die Ubiquitylierung auf Lysin 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Die hier beschriebene Massenspektrometrie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Chao-Jun Li vom Model Animal Research Center der Universität Nanjing für die Analyse der Massenspektrometrie. Wir danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa und aktuellen Forschern am Model Animal Research Center, der Nanjing University und dem Greehey Children es Cancer Research Institute für ihre hilfreiche Diskussion, experimentelle Beratung und Reagenzien. Wir danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago und Dawn S. Chandler für ihre großzügigen Reagenziengeschenke. Y.N. wurde vom Jiangsu Province ”Double-First-Class” Construction Fund, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province “Foreign Expert Hundred Talents Program” Fund (SBK2019010048) und National Natural Science Foundation in China (31970665) unterstützt. Diese Studie wurde teilweise durch das NGI-Stipendium R21 CA205659 unterstützt.
Materials
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | – | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | – | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | – | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | – | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | – | – | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | – | – | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | – | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | – | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | – | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | – | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | – | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | – | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | – | – | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | – | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | – | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | – | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | – | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | – | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | – | Software B2 |
References
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- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
