Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

סינתזה של Aptamer-PEI-g-PEG שונה חלקיקי זהב טעון עם וקסורוביצ'ין עבור משלוח תרופות ממוקדות

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61139
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 3, 3
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

Summary

בפרוטוקול זה, דולסורוביצ'ין טעון AS1411-g-PEI-g-PEG חלקיקי זהב שונה מסונתזים באמצעות תגובות אמיד שלושה שלבים. לאחר מכן, דוסורוביצ'ין נטען ונמסר כדי למקד תאים סרטניים לטיפול בסרטן.

Abstract

בשל עמידות לתרופות ורעילות בתאים בריאים, השימוש ב- doxorubicin (DOX) הוגבל בטיפול קליני בסרטן. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב של פולי (אתילנימין) מושתל עם פוליאתילן גליקול (PEI-g-PEG) חלקיקי זהב פונקציונליים (AuNPs) עם aptamer טעון (AS1411) ו DOX באמצעות תגובות אמיד. AS1411 מחובר במיוחד עם קולטני גרעין ממוקדים על תאים סרטניים, כך DOX מטרות תאים סרטניים במקום תאים בריאים. ראשית, PEG הוא carboxylated, לאחר מכן מושתל PEI מסועף כדי לקבל COPolymer PEI-g-PEG, אשר אושרה על ידי ניתוח 1H NMR. לאחר מכן, חלקיקי זהב מצופים קופולימר PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) מסונתזים, ו- DOX ו- AS1411 נקשרים בקובאליות ל- AuNPs בהדרגה באמצעות תגובות עמידות. הקוטר של AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs מוכן הוא ~ 39.9 ננומטר, עם פוטנציאל זטה של -29.3 mV, המציין כי חלקיקים יציבים במים ובינוני תאים. מבחני ציטוטוקסיות התא מראים כי AuNPs DOX שתוכנן לאחרונה מסוגלים להרוג תאים סרטניים (A549). סינתזה זו מדגימה את הסידור העדין של קופולימרים PEI-g-PEG, aptamers, ו DOX על AuNPs מושגים על ידי תגובות אמיד רציפות. כזה aptamer-PEI-g-PEG פונקציונלי AuNPs לספק פלטפורמה מבטיחה עבור אספקת תרופות ממוקדות בטיפול בסרטן.

Introduction

בהיותו הבעיה העיקרית בבריאות הציבור ברחבי העולם, סרטן מאופיין באופן נרחב כבעל שיעור ריפוי נמוך, שיעור הישנות גבוה ושיעור תמותה גבוה1,2. השיטות הקונבנציונליות הנוכחיות נגד סרטן כוללות ניתוח, כימותרפיה והקרנות3, ביניהן כימותרפיה היא הטיפול העיקרי לחולי סרטן במרפאה4. תרופות קליניות נגד סרטן בשימוש כוללות בעיקר paclitaxel (PTX)5 ו דוקסורוביצין (DOX)6,7. DOX, תרופה אנטי-ניאופלסטית, יושמה באופן נרחב בכימותרפיה קלינית, בשל היתרונות של ציטוטוקסיות סרטן ועיכוב התפשטות תאים סרטן8,9. עם זאת, DOX גורם לב-חזה10,11, ואת זמן מחצית החיים הקצר של DOX מגביל את היישום שלה במרפאה12. לכן, נשאי תרופות מתכלים נדרשים לטעון DOX ושחרור subequently באופן מבוקר לאזור ממוקד.

חלקיקים נמצאים בשימוש נרחב במערכות משלוח תרופות ממוקדות ויש להם מספר יתרונות בטיפול בסרטן (כלומר, יחס משטח לנפח גדול, גודל קטן, היכולת לתמצת תרופות שונות, כימיית משטח מתכווננת, וכו ') 13,14,15. בפרט, חלקיקי זהב (AuNPs) היו בשימוש נרחב ביישומים ביולוגיים וביו-רפואיים, כגון טיפול בסרטן פוטותרמי16,17. המאפיינים הייחודיים של AuNPs, כגון סינתזת facile ופונקציונליזציה משטח כללי, יש סיכויים מצוינים בתחום הקליני של טיפול בסרטן18. כמו כן, AuNPs שימשו כדי לזהות אסטרטגיות אספקת תרופות, לאבחן גידולים, להתגבר על ההתנגדות במחקרים רבים19,20.

למרות זאת, AuNPs צריך להיות מותאם עוד יותר כדי להתגבר על עמידות לסמים באמצעות שחרור מקומי גבוה בנגעים הגידול באמצעות חדירה משופרת ושמירה (EPR), כגון תכונות מיקוד ונגישות. תרופות רב-תכליתיות פולימריות הפגינו יתרונות ייחודיים, כגון מסיסות מים משופרת של תרופות הידרופוביות נגד סרטן וזמן זרימת דם ממושך21,22. פולימרים שונים בעלי תאימות ביולוגית שימשו לציפויים של AuNP, כגון פוליאתילן גליקול (PEG), פוליאתילנימין (PEI), חומצה היאלורונית, הפרין וקסנטן גאם. ואז היציבות, כמו גם את המטען, של AuNPs הוא השתפר היטב23. באופן ספציפי, PEI הוא פולימר מסועף מאוד המורכב מיחידות חוזרות רבות של אמינים ראשוניים, משניים ושלישוניים24. PEI יש מסיסות מעולה, צמיגות נמוכה, רמה גבוהה של פונקציונליות, אשר מתאים ציפוי על AuNPs.

מצד שני, תרופות נגד סרטן צריך להיות מועבר לתאי סרטן ישירות עם יעילות טעינה משופרת, ועם רעילות נמוכה יותר לטיפול בגידולים גרורתיים ראשוניים ומתקדמים25. ligands ממוקד יש פוטנציאל גדול עבור תרופות נגד סרטן ממוקד מערכות משלוח26. הסלקטיביות שלה עבור מולקולת היעד מחייב מעניק תרופה נגד סרטן מיקוד ספציפיות ומגביר את העשרת התרופה ברקמות חולות27. ליגנדים נוספים כוללים נוגדנים, פוליפפטידים ומולקולות קטנות. בהשוואה ליגנדים אחרים, חומצת גרעין aptamers יכול להיות מסונתז במבחנה והם קלים לשינוי. AS1411 הוא אוליגונוקלאוטיד phosphodiester 26 bp ללא שינוי המהווה מבנה G-tetramer דימרי יציב לאגד במיוחד קולטן חלבון גרעיני היעד overexpressed על תאים סרטניים28,29,30. AS1411 מעכב את התפשטותם של תאים סרטניים רבים אך אינו משפיע על הצמיחה של תאים בריאים31,32. כתוצאה מכך, AS1411 שימש כדי לפברק מערכת אספקת סמים ממוקדת אידיאלית.

במחקר זה, קופולימר PEI-g-PEG מסונתז באמצעות תגובת אמיד, אז PEI-g-PEG חלקיקי זהב מצופים (PEI-g-PEG@AuNPs) הם מפוברק. בנוסף, DOX ו- AS1411 מקושרים ברצף PEG@AuNPs PEI-g-g המוכן, כפי שמוצג באיור 1. פרוטוקול מפורט זה נועד לסייע לחוקרים להימנע רבים מהמלכודות הנפוצות הקשורות לייצור PEG@AUNPS PEI-g-PEG@AuNPs חדש טעון עם DOX ו- AS1411.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

התראה: הקפד להתייעץ עם כל גיליונות הנתונים הרלוונטיים לבטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש בכל הכימיקלים. כמה כימיקלים המשמשים להכנת copolymer וננו חלקיקים רעילים מאוד. חלקיקים יש גם סכנות פוטנציאליות. הקפד להשתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים וציוד מגן אישי, כולל כפפות, חלוק מעבדה, ברדסים, מכנסיים באורך מלא ונעליים קרובות.

1. סינתזה של פוליאתילן גליקול כפול קרבוקסיל (CT-PEG)33

  1. הוסף 1.46 גרם (14.6 mmol) של אנהידריד סוציני (SA) ו 209 מ"ג (1.71 mmol) של 4 דימתילמינופירידין (DMAP) לבקבוקון תחתון עגול 100 מ"ל.
  2. הוסף 15 מ"ל של tetrahydrofuran נטול מים (THF) לבקבוק המשמש בשלב 1.1 ולהתאים פקק זכוכית. שמור על הבקבוק ב 0 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  3. יש להוסיף 4.28 גרם (4.28 מ"ל) של פוליאתילן גליקול (PEG) ו-1.8 מ"ל (12.8 מ"ל) של טריאתילאמין (TEA) לבקבוקון חדש.
  4. הוסף 15 מ"ל של THF נטול מים לבקבוק המשמש בשלב 1.3 ולהתאים פקק זכוכית. להעביר את הפתרון לאט בקבוק בשימוש בשלב 1.2, באמצעות מזרק תחת אווירת חנקן.
  5. מערבבים את הפתרון ב 0 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות, ולאחר מכן להמשיך את התגובה בטמפרטורת החדר (RT) לילה.
  6. באמצעות מאייד סיבובי (40 °C (40 °C, 0.1 MPa), לרכז את פתרון התגובה ולהסיר את ממס THF.
  7. ב RT, להמיס את פתרון התגובה משלב 1.6 ב 15 מ"ל של 1.325 גרם / מ"ל dichloromethane (DCM), ולאחר מכן להוסיף 15 מ"ל של אתר דיתיל קר (Et2O) כדי לקבל את מוצר המשקעים (פוליאתילן גליקול diacid). הסר את הממס באמצעות נייר סינון.
    הערה: ניתן לחזור על שלב המשקעים פי 3.
  8. יבש את המשקעים תחת ואקום ב RT במשך 48 שעות.

2. סינתזה של קופולימר PEI-g-PEG

  1. הוסיפו 305.47 מ"ג CT-PEG משלב 1.8 ו-5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לבקבוק ומערבבים ב-RT כדי להבטיח שה-CT-PEG מומס במלואו ב-DMSO.
  2. להמיס 49.46 מ"ג של 1-(3-דימתילאמינופרופיל)-3-אתילקרבודימיד הידרוכלוריד (EDC) ב 5 מ"ל של DMSO, ולאחר מכן להוסיף את הפתרון לבקבוק בשימוש בשלב 2.1 ומערבבים במשך 30 דקות ב RT.
  3. להמיס 29.69 מ"ג של N-hydroxysuccinimide (NHS) ב 5 מ"ל של DMSO ולהוסיף את הפתרון בקבוק בשימוש בשלב 2.1. ממשיכים לבחוש ב-RT במשך 3 שעות.
  4. להמיס 28.6 μL של פוליאתילנימין (PEI) ב 10 מ"ל של DMSO ולהוסיף את הפתרון dropwise לבקבוק בשימוש בשלב 2.1. מערבבים במשך 3 ימים, לפחות.
  5. העבר את הפתרון המגיב משלב 2.4 לשקית דיאליזה (1,000 ניתוק משקל מולקולרי [MWCO]). מניחים את שקית הדיאליזה לתוך 1 L עם 500 מל של מים אולטרה סגולים כמו dialysate. לשנות את המים אולטרה דק כל 12 שעות במשך 3 ימים.
  6. להעביר את הפתרון בשלב 2.5 לשקית דיאליזה אחרת (10,000 MWCO). מניחים את שקית הדיאליזה לתוך 1 L עם 500 מל של מים אולטרה סגולים כמו dialysate. לשנות את המים אולטרה דק כל 12 שעות במשך 3 ימים.
  7. לרכז את הפתרון משלב 2.6 באמצעות מאייד סיבובי (40 °C (40 °C, 0.1 MPa) ולהקפיא לייבש את המדגם כדי להשיג את אבקת PEI-g-PEG.

3. סינתזה של PEI-g-PEG@AuNPs

  1. ממיסים 5 מ"ג של PEI-g-PEG מוכן (שלב 2.7) ב-5 מ"ל של מים אולטרה-דקים בבקבוקון חדש ומתאימים לעצירת זכוכית.
  2. הוסף 100 מ"ל של 0.3 mM HAuCl4 פתרון בקבוק ומערבבים את הפתרון במשך 3 שעות ב RT.
    הערה: צבע הפתרון צריך להשתנות מיד מצהוב לכתום.
  3. הוסף 1 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל NaBH4 פתרון בקבוק ומערבבים את הפתרון במשך 3 שעות ב RT.
    הערה: פתרון התגובה צריך להפוך באופן מיידי בורגונדי.
  4. חייג את מוצר התגובה באמצעות שקית דיאליזה (1,000 MWCO) במשך 3 ימים כמתואר בשלב 2.5 כדי להשיג את הפתרון PEI-g-PEG@AuNPs.

4. סינתזה של DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. הוסף 1 מ"ל של 2.2 מ"ג / מ"ל DOX פתרון ו 20 מ"ל של PEI-g-PEG@AuNPs פתרון בקבוק חדש ולהתאים עם פקק זכוכית.
  2. להמיס 0.727 מ"ג של EDC ב 1 מ"ל של מים אולטרה מתוקים ולהוסיף את פתרון EDC לבקבוק בשימוש בשלב 4.1.
  3. להמיס 0.437 מ"ג של NHS ב 1 מ"ל של מים אולטרה סגולים. מוסיפים את פתרון NHS לבקבוק ומערבבים ב- RT במשך שעה.
  4. חייג את מוצר התגובה באמצעות שקית דיאליזה (1,000 MWCO) במשך 3 ימים כמתואר בשלב 2.5 כדי להשיג את הפתרון DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

5. סינתזה של AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. הוסף 20 מ"ל של פתרון DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו- 4OD של AS1411 (OD = צפיפות אופטית; 1OD ≈ 33 מיקרוגרם) לבקבוקון חדש.
  2. להמיס 28.76 מ"ג של EDC ב 1 מ"ל של מים אולטרה מתוקים ולהוסיף את פתרון EDC לבקבוק בשימוש בשלב 5.1.
  3. להמיס 17.27 מ"ג של NHS ב 1 מ"ל של מים אולטרה סגולים. הוסף את פתרון NHS לבקבוק המשמש בשלב 5.1 ומערבבים את התגובה במשך שעה אחת ב- RT.
  4. חייג את מוצר התגובה באמצעות שקית דיאליזה (1,000 MWCO) במשך 3 ימים כמתואר בשלב 2.5 כדי להשיג AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. אפיון לדוגמה

  1. להמיס את פולימר CT-PEG (שלב 1.8) ו PEI-g-PEG copolymer (שלב 2.7) בכלורופורם-d בצינורות תהודה מגנטית גרעינית (NMR), בהתאמה. לנתח את הדגימות באמצעות ספקטרומטר NMR 600 MHz מצויד מגנט מוליך-על 14.09 T ו 5.0 מ"מ 600 MHz פס רחב Z-שיפוע בדיקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את המבנה הכימי34.
  2. פזרו את ה-AUNPs, DOX ו-AS1411 והכינו את PEI-g-PEG@AuNPs (שלב 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (שלב 4.4) ו-AS1411-G-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (שלב 5.4), בהתאמה במים אולטרה-דקים. לאחר מכן, העברה לקובטים והקלט ספקטרום אולטרה סגול גלוי (UV-vis) באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.
  3. חבר דבק דו-צדדי (~ 2 מ"מ x 2 מ"מ) לנייר אלומיניום, וטבל את הפתרון לדוגמה (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) בקלטת כולה באופן אחיד. לנתח את הדגימות באמצעות מנתח ספקטרוסקופיה פוטואלקטרון רנטגן.
  4. פזרו פתרונות PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ופתרונות PEG@AUNPS AS1411-G-DOX-g-PEI-g-g,, בהתאמה במים אולטרה-דקים. לאחר מכן, העבר ל- cuvettes והערך את התפלגות הגודל באמצעות פיזור אור דינמי.
  5. פזרו פתרונות PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ופתרונות PEG@AUNPS AS1411-g-DOX-G-PEI-g-g במים אולטרה-דקים (טיפה אחת של דגימה לכל 5 מ"ל מים אולטרה-דקים עבור כל דגימה). סוניקאט ל-2 שעות. טובלים את רשת הנחושת בפתרונות לדוגמה ומתייבשים תחת מנורת אינפרא אדום. לאפיין את המורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
  6. הזרק 1 מ"ג של AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs לתוך 20 kDa MWCO קלטת דיאליזה, ולאחר מכן למקם 80 מ"ל של מלוחים מאגר פוספט (PBS) עם 5% אלבומין סרום בקר (BSA). מערבבים ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. בנקודות הזמן שנקבעו מראש, לאסוף 100 μL aliquots ולהחליף עם PBS טרי. השתמש ספקטרופוטומטר UV-vis כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות DOX של aliquots.

7. CCK-8 מבחנים של חלקיקי AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. לגדל תאי A549 במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברי, 100 U / mL פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין תחת אווירה לחה של 95% אוויר ו 5% CO2 ב 37 °C (67 °F). החלף את מדיום התרבות כל יומיים. השתמש בתאים במעבר 5 עבור התפשטות התא ו cytotoxicity מבחנים כדי להעריך כמותית את cytotoxicity של מוכן AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs חלקיקים.
  2. הוסף 100 μL של פתרון חלקיקים לתוך כל באר מכילים 1 מ"ל של מדיום התא. לאחר culturing עבור 24 שעות ו 48 שעות, להסיר את המדיה תרבות מצלחות תרבות התא, ולאחר מכן להוסיף 300 μL של מדיה תרבות טריים ו 30 μL של ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) פתרונות ערכת מיד לכל באר. דגירה עבור 4 שעות באינקובטור CO2 ב 37 °C (69 °F).
  3. העבר 200 μL של פתרונות תגובה משלב 7.2 לתוך צלחת באר 96. קרא את הצפיפות האופטית (OD) של כל באר ב 570 ננומטר עם קורא microplate.
  4. שימו לב למורפולוגיה של התאים במהירות של 24 שעות ו-48 שעות מתחת למיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 ספקטרוסקופיית H NMR שימשה לאישור הסינתזה המוצלחת של פולימר CT-PEG וקופולימרים PEI-g-PEG(איור 2). איור 2a מראה כי אות פרוטון מתילן ב- δ = 3.61 עמודים לדקה ואות פרוטון קרבוקסיל ב- δ = 2.57 עמודים לדקה מאשרים את הסינתזה המוצלחת של פולימרים CT-PEG. איור 2b מראה כי אות פרוטון המתילן של PEG ב- δ = 2.6 עמודים לדקה ואות פרוטון של PEI ב- δ = 1.66 עמודים לדקה מאשרים את הסינתזה של קופולימרים PEI-g-PEG.

ספקטרוסקופיית UV-vis נערכה כדי לקבוע את התפקוד המוצלח של קופולימר מוכן על AuNPs (איור 3). בספקטרום UV-vis, נוכחות הלהקות ב ~ 523 ננומטר, 507 ננומטר, ו 260 ננומטר תואמת את פסגות תהודה פלסמון פני השטח (SPR) של AuNPs, DOX, ו AS1411, בהתאמה (איור 3a). הלהקות ב ~ 360 ננומטר בספקטרום UV-vis של PEI-g-PEG@AuNPs, ~ 532 ננומטר בספקטרום UV-vis של DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, ו ~ 546 ננומטר בספקטרום UV-vis של AS1411-g-DOX-G-PEI-g-PEG@AuNPs לאשר את הסינתזה המוצלחת של COPolymers PEI-g-PEG המצורפת AuNPs. הם גם מאשרים כי DOX ו- AS1411 נטענו על AuNPs פונקציונליים בהדרגה (איור 3b).

ספקטרוסקופיית צילום רנטגן (XPS) שימשה לחקירת הקשר הכימי של קופולימר ב- AuNPs (איור 4). ספקטרום ה-XPS של פסגות PEI-g-PEG@AuNPs הראה כי פסגות C1s, O1s, N1s ו- Au4f הצביעו על הקשר בין AuNPs לבין קופולימר PEI-G-PEG (איור 4a). חל שינוי קל בספקטרום ה-XPS של DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, שכן DOX הושתלה עוד יותר ב-PEI-g-PEG@AuNPs(איור 4b). יתר על כן, המראה של פסגת P2p עבור AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs נבע בעיקר השתלה מוצלחת של AS1411 על DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(איור 4c). התפלגות הגודל של חלקיקים מוכנים נותחה באמצעות DLS (איור 5). בהשוואה ל- PEI-g-PEG@AuNPs, קוטר הלחות הממוצע גדל מעט ב- DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs וגדל עוד יותר לאחר שה- AS1411 הושתל.

TEM שימש לקביעת המורפולוגיה של הננו-חלקיקים, והתמונות הראו כי כל הננו-חלקיקים היו אחידים ללא צבירה(איור 6). בשל האינטראקציות בין copolymers על פני השטח של AuNPs, המרחק של AuNPs גדל בהדרגה. נעשה שימוש בבדיקת כדאיות של תא כדי לקבוע את מאפיין היעד של מערכת המסירה DOX המוכנה (איור 7 ואיור 8). תוצאות CCK-8 (איור 7) הראו כי 1) מספר התאים A549 ירד לאחר culturing עם AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs לאורך זמן ו 2) מספר התא ירד עם ריכוז מוגבר של חלקיקים. בהשוואה לקבוצת DOX חינם, מספר התא גדל, המציין כי הרעילות הופחתה.

יחד עם תמונות מיקרוסקופיה אופטיות (איור 8),התוצאות מראות כי מספר התאים ירד לאחר culturing עם AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (איור 8a-d)בהשוואה לקבוצת הביקורת מבלי להוסיף חלקיקים (איור 8e,f). יתר על כן, פרופיל שחרור DOX מ AS1411-g-DOX-g-G-PEI-g-PEG@AuNPs ב- PBS נחקר (איור 9). התוצאות מראות כי שחרור מתמשך של DOX מן חלקיקים פונקציונליים גרם לירידה בתאי A549, ואת שחרור DOX המצטבר היה כ 63.5% ± 3.2% ב 72 שעות.

Figure 1
איור 1: איור סכמטי של סינתזה של PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP ו- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ספקטרוםNMR אחד של (א) פולימר CT-PEG מסונתז ו-(ב) קופולימר PEI-g-PEG. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ספקטרום UV-vis של (א) AuNPs, DOX ו- AS1411 ו- (ב) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו- AS1411-G-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ספקטרום XPS של (א) PEI-g-PEG@AuNPs, (ב) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו-(ג) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התפלגות גודל של PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = קוטר ממוצע של הננו-חלקיק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונות TEM של (א) PEI-g-PEG@AuNPs, (ב) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו-(ג) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
סרגלי קנה מידה = 50 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ערכי צפיפות אופטית ב- 570 ננומטר (OD570) של תאי A549 לאחר culturing עם AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 מיקרוגרם/מ"ל ו- 110 מיקרוגרם/מ"ל) עבור 24 שעות ו- 48 שעות, בהתאמה.
תאים עם DOX ותאים ללא תשלום מבלי להוסיף חלקיקים נכללים כקבוצות בקרה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תמונות מיקרוסקופיות אופטיות של תאי A549 לאחר culturing עם AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ב 220 מיקרוגרם / מ"ל (a,b) ו 110 מיקרוגרם / מיליליטר (c, d), או culturing מבלי להוסיף חלקיקים כקבוצת ביקורת (e,f) ב 24 שעות (לוחות עליונים) ו 48 שעות (לוחות תחתונים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: פרופיל שחרור של DOX מ- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ב- PBS עבור 72 שעות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ספקטרום NMR 1H (איור 2) מאשר את הסינתזה המוצלחת של קופולימר CT-PEG וקופולימר PEI-g-PEG. המשקולות המולקולריות של PEG ו-PEI היו 1,000 ו-1,200, בהתאמה. בנוסף, המערכת הקטליטית EDC / NHS שימשה לסנתז PEI-g-PEG קופולימר באמצעות תגובות אמיד. יש לציין כי אם המשקלים המולקולריים של PEG ו- PEI השתנו לסנתז PEI-g-PEG copolymer, אז זמן התגובה ואת המערכת הקטליטית צריך להיות הערכה מחדש. כמו כן, מצב התגובה עבור ציפוי COPolymer PEI-G-PEG על AuNPs צריך להיות מותאם עוד יותר, בעיקר בגלל משקל המולקולה ומבנה של COPolymer PEG-G-PEI יכול להשפיע על יעילות הציפוי וקוטר של AuNPs. לאחר מכן, ניתן לשנות גם את המורפולוגיה של ה-AuNPs הפונקציונליים של הקופולימר. מספר קבוצות האמינו מפולימר PEI יכול להשפיע על המבנה של סינתזת הקופולימר הסופית PEI-g-PEG, ופעולת ההצלבה בין PEI ל- CT-PEG תתרחש באופן בלתי נמנע. לכן, שלב 2.4 צריך להתבצע בזהירות, ואת פתרון PEI צריך להיות הוסיף לאט טיפה אחר טיפה. לאחר תגובת הסינתזה, יש להפעיל דיאליזה (שלבים 2.5 ו-2.6) כדי להסיר את הקופולימרים והפולימרים הלא מקושרים.

יתר על כן, DOX ו AS1411 מתפקדים ברצף על PEI-g-PEG@AuNPs באמצעות תגובות amide, ואת המערכת EDC / NHS קטליטי משמש. זה דורש 3 ימים עבור כל תגובה (שלב 4.3 ושלב 5.3) כאן; עם זאת, אם זמן התגובה דורש פחות מ -3 ימים, יעילות הפונקציונליזציה תקטן. כאשר נדרשים יותר מ 3 ימים, אותה תוצאה הושגה. יש לציין כי EDC כימי, NHS, ו DOX מחובר או AS1411 ניתן להסיר באמצעות טיפול דיאליזה (שלב 4.4 ושלב 5.4). ספקטרום UV-vis ו-XPS הן שיטות יעילות לבדיקת התפקוד המוצלח של קופולימר על חלקיקים, והתקבלו תוצאות עקביות (איור 3 ואיור 4).

בשונה מהלהקות האופייניות של UV-vis של AuNPs, DOX ו- AS1411, פסגות ייחודיות של PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו- AS1411-G-DOX-G-PEI-g-PEG@AuNPs מאתגרות לצפייה, בשל החפיפה של כל פסגה. יתר על כן, ביצענו שיטה שונה כדי ליצור DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (לסנתז DOX-g-PEI-g-PEG הראשון, והישגים של פונקציונליזציה על AuNPs); עם זאת, חלקיקי זהב באמצעות גישה כזו הובילה יעילות טעינה DOX נמוך35,36. לכן, יש לציין כי השיטה לסינתזה של DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs בעבודה זו תבטיח יעילות טעינה DOX מספיק, כמו גם פרופיל שחרור נוסף. אם ניסוי אינו לוקח יעילות טעינה DOX של חלקיקי זהב בחשבון, ישנן שיטות אחרות כדי להשיג AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. אלה כוללים סינתזה של DOX-g-PEI-g-PEG או AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG באמצעות תגובת עמיד תחילה, ולאחר מכן פונקציונליזציה על חלקיקי זהב. לכן, השיטה המשמשת כאן, כמו גם copolymers המתקבל ניתן ליישם יישומים רפואיים מגוונים, כגון הנדסת רקמות.

התפלגות הגודל והמורפולוגיה של חלקיקים מוכנים יכולים להיחקר על ידי DLS ו- TEM. נתוני DLS (איור 5)מראים כי חלקיקי קוטר הלחות משתנים מציפויים שונים, ויותר משיא אחד מופיע עבור כל דגימה. לגבי המבנה של PEI-g-PEG (איור 1), עקומת ההתפלגות הרגילה של DLS אינה נצפית. יש לציין כי הננו-חלקיקים מפוזרים במים אולטרה-דקים במהלך בדיקת ה- DLS, נעשה שימוש ביחסי נפח שונים, ועדיין קיימים פסגות מרובות, עקב אינטראקציות בין קופולימרים על פני השטח של חלקיקים. לכן, תמונות TEM משמשים כדי לאשר את המורפולוגיה של חלקיקים. תמונות TEM של PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ו- AS1411-g-DOX-PEI-g-g-PEG@AuNPs מוצגות באיור 6.

בהתבסס על רכיבים שונים של משטחי חלקיקי זהב, מרחקים בין חלקיקים משתנים. חוץ מזה, חלקיקים מוכנים מפוזרים במים יציבים על פי בדיקות זטה פוטנציאליות (-29-50 mV עבור חלקיקים שונים לאחר בדיקות זמן). פונקציונליזציה נוספת של DOX ו AS1411 (סעיפים 4 ו 5 של הפרוטוקול) אינם משפיעים על הקוטר של חלקיקי זהב. ניתן להסיק כי UV-vis היא שיטה יעילה כדי לאשר DOX ו AS1411 טעון על חלקיקים מבלי להשתמש בכל שיטות הבדיקה.

הנכס הממוקד על תאים סרטניים נחקר באמצעות תאים A549 מתורבת עם ריכוזים שונים של AS1411 מוכן DOX טעון AuNPs ומבלי להוסיף חלקיקים כקבוצת ביקורת. במקביל נבדקו גם ההשפעות של DOX בחינם על יכולת הקיום של התאים A549 (איור 7 ואיור 8). בהשוואה לקבוצה מבלי להוסיף חלקיקים, AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs להוביל לירידה בתאי A549. עם זאת, בעוד הריכוז של חלקיקים להקטין (100 מיקרוגרם / מ"ל), התאים מראים פעילות טובה יותר ב 24 שעות לעומת קבוצת DOX חינם. הסיבה לכך היא בעיקר כי קופולימר PEI-g-PEG יש cytocompatibility מעולה37 ואת הרעילות הלא ספציפית של פולימר PEI מסועף הוא ameliorated.

לבסוף, בשל המאפיין הממוקד של aptamer AS1411, חלקיקים המתקבלים מצטברים בתאים סרטניים במקום תאים בריאים. לאחר aptamer מוכר, DOX הוא שוחרר להרוג את התאים הסרטניים. פרופיל השחרור של DOX מ- AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs ב- PBS נרשם (איור 9). פרוטוקול זה מדגים גישה להכנת aptamers ו DOX מושתל על קופולימר שונה AuNPs באמצעות תגובת אמיד רב שלבים. חלקיקים מסונתזים יש פוטנציאל עבור יישומים לטיפול בסרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31700840); פרויקט המחקר המדעי המרכזי של מחוז הנאן (18B430013, 18A150049). מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המלומדים של נאנחו לחוקרים צעירים של XYNU. המחברים רוצים להודות לסטודנט לתואר ראשון זבו קו מהמכללה למדעי החיים ב- XYNU על יצירותיו המועילות. המחברים רוצים להכיר במרכז ניתוח ובדיקות של XYNU לשימוש בציוד שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Dimethylaminopyridine Macklin D807273
A549 cell ATCC CCL-185TM
AS1411 BBI Life Sciences Corporation 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8) Sigma Aldrich 96992-500TESTS-F
Dichloromethane Traditional Chinese medicine 80047318
Diethyl ether (Et2O) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide Macklin D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride Rhawn R017518
Ether absolute Traditional Chinese medicine 80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope FEI Company Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate Rhawn R016035
Laser Particle-size Instrument Malvern Instruments Ltd ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Macklin N808856
N-Hydroxysuccinimide Macklin H6231
NMR software Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer JEOL JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5 OriginLab
Penicillin Sigma Aldrich V900929-100ML
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 81188 BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution Sigma Aldrich 482595 average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder Acros C18930
Streptomycin Sigma Aldrich 85886-10ML
Succinic anhydride Traditional Chinese medicine 30171826
Tetrahydrofuran Traditional Chinese medicine 40058161
Triethylamine Traditional Chinese medicine 80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer Lambda950 Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer Thermo Fisher Scientific K-ALPHA 0.5EV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  3. Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
  4. Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
  5. Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
  6. Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
  7. Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
  8. de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
  9. Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
  10. Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
  11. Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
  12. Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
  13. Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
  14. Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
  15. Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
  16. Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
  17. Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
  18. Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
  19. Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
  20. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
  21. Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
  22. Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
  23. Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
  24. Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
  25. Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
  26. Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
  27. Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
  28. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  29. Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
  30. Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
  31. Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
  32. Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
  33. Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
  34. Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
  35. Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
  36. Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
  37. Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).

Tags

כימיה גיליון 160 aptamer חלקיקי זהב דוסורוביצ'ין קופולימר משלוח תרופות טיפול בסרטן
סינתזה של Aptamer-PEI-g-PEG שונה חלקיקי זהב טעון עם וקסורוביצ'ין עבור משלוח תרופות ממוקדות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., … More

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., Zhang, Z., Zheng, L., Wang, L. Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery. J. Vis. Exp. (160), e61139, doi:10.3791/61139 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter