인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

Teresa  P. Silva; Tiago G. Fernandes; Diogo  E. S. Nogueira; Carlos  A. V. Rodrigues; Evguenia  P. Bekman; Yas Hashimura; Sunghoon Jung; Brian Lee; Maria Carmo-Fonseca; Joaquim  M. S. Cabral

doi:10.3791/61143

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방법 논문

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

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DOI:

10.3791/61143

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2020년 6월 13일

Teresa P. Silva¹^,² , Tiago G. Fernandes¹ , Diogo E. S. Nogueira¹ , Carlos A. V. Rodrigues¹ , Evguenia P. Bekman¹^,²^,³ , Yas Hashimura⁴ , Sunghoon Jung⁴ , Brian Lee⁴ , Maria Carmo-Fonseca² , Joaquim M. S. Cabral¹

¹iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, ²Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, ³The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, ⁴PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포의 제어된 크기 응집을 생성하고 단일 사용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 소뇌 유기체의 분화를 더욱 자극하는 동적 배양 시스템을 설명합니다.

초록

소뇌는 균형과 모터 조정의 유지 보수에 중요한 역할을하며, 다른 소뇌 뉴런의 기능적 결함은 소뇌 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 질병 관련 신경 표현형에 대한 현재 지식의 대부분은 질병 진행 및 발달의 이해를 어렵게 하는 사후 조직을 기반으로 합니다. 동물 모델과 불멸의 세포주 또한 신경 퇴행 성 장애에 대 한 모델로 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 완전히 인간의 질병을 되풀이하지 않습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)는 질병 모델링을위한 큰 잠재력을 가지고 있으며 재생 접근에 대한 귀중한 소스를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 환자 유래 iPSC에서 대뇌 오르가노이드의 생성은 신경 퇴행성 질환 모델링에 대한 전망을 향상. 그러나, 많은 수의 오르가노이드를 생성하는 프로토콜과 3D 배양 시스템에서 성숙한 뉴런의 높은 수율은 부족합니다. 제시된 프로토콜은 유기체가 소뇌 정체성을 취득하는 확장 가능한 일회용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의된 조건하에서 인간 iPSC 유래 오르가노이드의 재현 가능하고 확장 가능한 생성을 위한 새로운 접근법입니다. 생성된 오르가노이드는 mRNA 와 단백질 수준에서 특정 마커의 발현을 특징으로 한다. 단백질의 특정 단의 분석은 오르가노이드 구조의 평가에 중요 한 다른 소뇌 세포 집단의 검출을 허용. 유기체 극저분과 오르가노이드 슬라이스의 추가 면역 염색은 특정 소뇌 세포 집단과 공간 조직의 존재를 평가하는 데 사용됩니다.

서론

인간 만능 줄기세포(PSC)의 출현은 이러한 세포가^인체의대부분의 세포 계보로 분화될 수 있기 때문에 재생 의학 및 질병 모델링을 위한 우수한 도구를 나타낸다^1,^2. 이들의 발견 이후, 다양한 접근법을 이용한 PSC 분화는 신경퇴행성 질환^3,^4,^,⁵^5,⁶등 다양한 질병을 모델링하는 것으로 보고되었다.^,

최근에는 인간 뇌 구조를 닮은 PSCs로부터 파생된 3D 배양에 대한 보고가 있었습니다. 이들은 뇌 오르가노이드^3,^,^7,^,^{8이라고합니다.} 건강하고 참을성 있는 특정 PsCs 둘 다에서 이 구조물의 생성은 인간 발달 및 신경 발달 무질서를 모델링할 귀중한 기회를 제공합니다. 그러나, 이러한 잘 조직된 대뇌 구조를 생성하는 데 사용되는 방법은 대규모 생산....