細菌性角膜炎に対する薬物治療を研究するためのブタEx Vivoコルネアモデルの確立
Summary
この記事では、細菌性角膜炎のex vivo ブタモデルを設定するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。 緑膿菌 は原型生物として用いられる。細菌増殖は、細菌が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するように、この革新的なモデルは、生体内感染を模倣する。
Abstract
新しい抗菌剤を開発する場合、動物試験の成功は、生体内検査から生体内の動物感染までの抗菌効果の正確な外挿に依存する。既存のin vitro試験は、典型的には拡散障壁としての宿主組織の存在が考慮されないとして抗菌効果を過大評価する。このボトルネックを克服するために、緑膿菌を原型生物として使用した細菌性角膜炎 の エキビボブタコネ角膜モデルを開発しました。この資料では、ブタの角膜の調製と感染の確立のためのプロトコルについて説明します。別注ガラス型は、感染研究のための角膜の簡単なセットアップを可能にする。このモデルは、細菌の増殖が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するので、生体内感染を模倣する。感染の確立は、生存可能なプレート数を介して評価されるコロニー形成ユニットの数の増加として検証される。この結果は、ここで説明する方法を用いて、ex vivo角膜において非常に再現性の高い方法で感染を確立できることを示している。このモデルは、 将来的にP.緑素症以外の微生物によって引き起こされる角膜炎を模倣するために拡張することができます。このモデルの究極の目的は、生体内感染をより代表的なシナリオで抗菌化学療法が細菌感染の進行に及ぼす影響を調査することである。そうすることで、ここで説明するモデルは、検査のための動物の使用を減らし、臨床試験での成功率を向上させ、最終的には新しい抗菌薬をクリニックに迅速に翻訳することを可能にする。
Introduction
角膜感染症は失明の重要な原因であり、低所得国と中所得国の流行割合で発生します。この疾患の病因は地域によって異なるが、細菌はこれらの症例の大部分を占める。緑膿菌は、急速に進行する疾患を引き起こす重要な病原体である。多くの場合、患者は、間質瘢痕、不規則な乱視、移植を必要とする、または最悪のシナリオでは、目1、2を失う。
P.緑素症によって引き起こされる細菌性角膜炎は、特にP.緑素症の抗菌耐性株の出現の増加に起因する治療が困難な眼感染症である。過去10年の間に、角膜感染症の新しい治療法の試験と開発、一般的に、特にシュードモナスspによって引き起こされるものは、抗生物質耐性3の現在の傾向に対抗するために不可欠であることが明らかになった。
角膜感染症に対する新しい治療法の有効性を試験するために、従来のインビトロ微生物学的方法は、実験室培養中および生体内感染中の細菌生理学の差と、宿主界面4,5の欠如による貧弱な代理である。しかし、生体内動物モデルは高価で時間がかかり、少数の複製を提供し、動物の福祉に関する懸念を提起することができます。
本稿では、急性および慢性感染症に対する様々な治療法の試験に使用できる角膜炎の、簡単で再現可能なorganotypic ex vivoブタモデルを示す。今回の実験では P.緑素吸い分を 用いていますが、他の細菌や角膜炎を引き起こす真菌や酵母などの生物ともうまく機能します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このケラティスモデルの開発の主な要因は、前臨床段階で抗菌効果をより正確に決定するために、代表的なin vitroモデルを新しい抗菌剤を開発する研究者に提供することです。これは、新しい抗菌薬の開発に関与する研究者に、前臨床段階での薬物設計と製剤をより詳細に制御し、臨床試験での成功を高め、標的研究を可能にすることによって動物の使用を減らし、新しい抗菌薬を診療所に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、チェスターフィールドのエリオット・アバトワールが豚の目を提供してくれたことに感謝したいと考えています。ガラスリングは、シェフィールド大学化学科のガラスブロワーダンジャクソンによって私たちのデザインに基づいて作られました。著者らは、医学研究評議会(MR/S004688/1)の資金調達に感謝したいと考えています。著者らはまた、角膜の準備に関する技術的な助けをしてくれたシャナリ・ディクウェラ夫人に感謝したいと考えています。著者たちは、写真の書式設定に協力してくれたジョナサン・エメリー氏に感謝したいと考えています。
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
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