我们模拟了一个简单的多重ECL检测,将7种自身抗体检测组合在一起。该测定能够同时筛查 T1D 和多种其他自身免疫性疾病,包括乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病和自身免疫性多腺综合征 1。
胰岛自身抗体(IAbs)广泛用于1型糖尿病(T1D)的诊断和预测。胰岛素 (IAA)、谷氨酸脱羧酶-65 (GADA)、胰岛素瘤抗原-2 (IA-2A) 和锌转运蛋白-8 (ZnT8A) 的四种主要 IAb 在疾病预测中同样重要。目前,高达40%的T1D诊断患者继续发展为其他自身免疫性疾病。不幸的是,目前使用单一自身抗体进行测量的筛选方法对于大规模筛选研究来说既费力又低效。我们最近开发了一种简单的多重电化学发光(ECL)测定来解决这些当前问题。该测定将所有 7 种自身抗体测试组合到一个孔中。每个孔包括三个 IAb(IAA、GADA 和 IA-2A)、甲状腺过氧化物酶 (TPOA) 和甲状腺球蛋白 (ThGA) 自身抗体以检测自身免疫性甲状腺疾病、组织谷氨酰胺转移酶 (TGA) 自身抗体(用于乳糜泻)和自身免疫性多腺综合征 (APS-1) 的干扰素 α 自身抗体 (IFNαA);所有这些都同时筛查T1D和其他相关的自身免疫性疾病。多重ECL检测基于单个ECL检测平台,而是使用多重板将多种自身抗体检测(最多10个)组合到一个孔中。与单一ECL测定的主要区别在于,在液相中形成的每个抗体-抗原复合物通过多重板上的接头系统被限制在每个孔的特定点上。在本研究中,7-Plex ECL 测定针对标准放射性结合测定 (RBA) 和单次 ECL 测定进行了验证,使用大量新诊断的 T1D 患者和年龄匹配的健康对照,从而具有出色的测定灵敏度和特异性。
1型糖尿病(T1D)是一种严重的慢性疾病,最常见于儿童期。目前,美国约有 140 万人患有 T1D;引人注目的是,全球T1D的发病率以每年3-5%的速度稳步增长,并且在过去二十年中翻了一番,特别是在幼儿中1,2。血液循环中的胰岛自身抗体(IAbs)是目前最可靠的生物标志物。IAbs可能在临床T1D发展前数年出现3。目前,四种主要的IAb广泛用于T1D诊断和风险筛查,包括胰岛素自身抗体(IAA),谷氨酸脱羧酶-65(GADA),胰岛素瘤抗原-2(IA-2A)和锌转运蛋白-8(ZnT8A)。这四个IAb在预测T1D发展方面同样重要。T1D 的分类最近被重新定义为存在任何 4 个 IAb 中的 ≥2 个,血糖代谢正常,作为疾病 14 期。
在年轻人的糖尿病自身免疫研究(DAISY)中,发现四分之一有T1D风险的儿童可能会进展为胰岛,乳糜泻,甲状腺或类风湿自身免疫,更引人注目的是,大约40%被诊断患有T1D的患者最终会发展为额外的自身免疫性疾病5,6,7.自身抗体的鉴定对于预测和诊断这些自身免疫性疾病至关重要,应为患者提供更好的临床护理。目前还没有简单且廉价的方法来筛查这些多种自身免疫性疾病。目前使用标准放射性结合测定(RBA)和单一自身抗体测量的筛选方法对于大规模筛选来说既费力又低效。
在这里,我们将描述新开发的简单多重ECL检测,我们已经使用单个ECL检测平台8,9,10,11对其进行了验证。多重 ECL 检测将 7 种自身抗体检测结合到一个孔中,仅使用 15 μL 血清,能够同时筛查 T1D 和多种相关自身免疫性疾病,包括乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病和 APS-1。当时尚未开发ZnT8A ECL测定,因此未包含在多重测定中。多重ECL检测为一般人群筛查T1D和多种自身免疫性疾病提供了出色的工具。
在众多针对 1 型糖尿病的国家和国际临床试验中,单一 ECL 测定检测胰岛自身抗体和乳糜泻谷氨酰胺转移酶 (TGA) 自身抗体的性能已得到证实8,9,10,11。在这些试验中,当根据现有的“金”标准RBA进行评估时,该测定提高了自身抗原检测的灵敏度和特异性。在单次ECL测定和RBA14,15,16,17之间区分高亲和力和高风险胰岛自身抗体与低风险,低亲和力信号时,可以看到增强的疾病特异性。在单一ECL检测的基础上,我们提出了一种新的高通量多重ECL自身抗体检测,使我们能够同时筛查T1D以及几种适用的自身免疫性疾病。
多重ECL检测使用多重板,可将多达10种自身抗体检测组合到一个孔中。在本研究中,将7种自身抗体测定组合在一起。自身抗体包括 3 种 IAb(IAA、GADA 和 IA-2A)、2 种自身免疫性甲状腺疾病自身抗体(TPOA 和 ThGA)、乳糜泻自身抗体 (TGA) 和 APS-1 干扰素 α 自身抗体 (IFNαA)。通常,该测定机制基于先前发表的9,10,12,18的单一ECL测定,并进行了一些修改。多重ECL检测与单一ECL检测的主要区别在于,在液相中形成的每个抗体-抗原复合物都被限制在特定的接头上(图1)。生物素标记的抗原与链霉亲和素偶联物一起孵育,链霉亲和素是用于形成特异性抗原-接头复合物的接头。抗体-抗原免疫复合物在与患者血清孵育后形成,并通过多重板每个孔上的特异性接头系统捕获到特定点上。Ru Sulfo-NHS标记的抗原被抗体捕获,同时提供电化学发光信号。酶标仪可以检测来自每个孔中的点光源的多达 10 个不同信号。为了在进行长期研究时保持板之间的自身抗体测定一致,我们建议使用相同的接头。
在建立多重ECL检测之前,需要分别在多重板上优化每种自身抗体的单次ECL检测,并在常规ECL板上针对RBA和单ECL检测进行验证。为了增强棋盘格测定,对多重板上的相关自身抗体测定,使用了高阳性患者和阴性患者样本。进行棋盘测定后,计算7种自身抗体测定中每种最理想的Ru Sulfo-NHS和生物素标记抗原浓度。下面显示了这些浓度:GAD65为30 ng/mL和200 ng/mL,胰岛素原为120 ng/mL和120 ng/mL,IA-2为10 ng/mL和42 ng/mL,TG为80 ng/mL和80 ng/mL,TPO为8 ng/mL和16 ng/mL,ThG为31 ng/mL和31 ng/mL, IFNα 13 分别为 12 ng/mL 和 12 ng/mL。将所有测定组合在一起后,可能需要根据实际多重测定的结果进一步调整棋盘测定中某些抗原的浓度。
由于IAA包含在目前的多重ECL测定中,因此在将血清与抗原孵育之前,必须对血清样品进行酸处理,如先前的研究12所述。通常,当在多重检测中加入额外的自身抗体时,检测背景会受到影响,并且来自孔中一个点的极高信号可能会通过串扰阻碍附近斑点的结果。因此,对于最高阳性样品,每个自身抗体的最大CPS需要限制为20,000个计数,或更低。据我们所知,为了减少涉及的串扰量,在设计斑点图时,应将背景较低的自身抗体与计数频率较高的斑点分开。
在每次测定中内部使用高阳性和阴性对照,以计算被测未知样品的准确指数。为了准确评估和监测测定的灵敏度,使用了设置在测定上限附近的低阳性对照。这些标准阳性和阴性对照以批量和等分试样形式创建以供长期使用,并储存在-20°C或更低温度下,以确保测定之间的一致性。出于质量保证的目的,每次检测中都运行两次样品,然后重新运行每个阳性结果,并在第二天通过新的ECL检测来确认样品。如果对第一和第二验证性测定有任何分歧,则需要进行第三次测定。在进行的三种测定中,一致的两种测定的结果(例如,+,+或-,-)决定了样品的最终结果(阳性或阴性)。
在过去十年中,许多研究小组正在寻求一种利用多重方法将多种自身抗体检测组合成一个孔以筛选大量人群的高通量检测。有一些研究正在使用不同类型的技术进行多重自身抗体检测19,20,21,22,但在研究T1D时,这些检测的灵敏度和特异性与当前的“黄金”标准RBA没有可比性。所使用的这些不同类型的平台未通过国际胰岛自身抗体标准化计划(IASP)研讨会或通过在临床试验中测试大型队列进行验证。在德国最近进行的基于一般人群的筛查中,Kronus 分发的高通量联合检测 3 Screen ICATM ELISA 正被用作一线筛查的工具,以检测三种 IAb、GADA、IA-2A 和 ZnT8A,以实现儿童 T1D23 的早期诊断。3 筛选 ELISA 测定法可在 3 个分离的孔中测量 3 种自身抗体,消耗大量血清,或在混合所有 3 种检测的单个孔中测量 3 种自身抗体。如果 3 屏幕 ELISA 测定中的一个孔呈阳性,则无法区分存在三种自身抗体中的哪一个。该测定的最大缺点是无法包括IAA测量。正如IASP讲习班所证明的那样,ELISA进行的所有IAA结果都不具有可接受的敏感性和特异性24。IAA通常是第一个出现的IAb,在幼儿中患病率很高。与IAA一起进行IAb筛查对儿童是必要的,在没有IAA评估社区T1D风险的情况下进行这种筛查是不可接受的。此外,没有已发表的研究或数据显示 Kronus IAb 试剂盒检测更具 T1D 疾病特异性,能够区分高风险和低风险 IAb。在本研究中,7-Plex ECL测定使用大量新诊断的T1D13患者进行了验证。与当前标准RBA和成熟的单一ECL检测相比,7-Plex检测能够以相同的检测特异性保持100%的阳性性(表4)。目前,与标准RBA并行的4-Plex ECL测定正在应用于正在进行的大型临床试验:儿童自身免疫筛查(ASK)研究。该试验对丹佛大都会区普通人群中的儿童进行T1D和乳糜泻筛查。与ASK研究中使用的标准RBA相比,多重ECL测定显示出出色的灵敏度和更高的疾病特异性,与我们之前使用单个ECL研究的报告相同25。此外,与相应的 4 次 ECL 和 RBA 单次检测相比,我们的 4-Plex ECL 检测表明,劳动力、成本和血清量显著减少了 70%。使用多重ECL测定,我们可以用不同的数字定制每个孔,代表不同的自身抗体(最多10种),以测试特定于特定临床位置需求的不同自身免疫性疾病。
本研究显示,对于使用多重板的多重ECL测定,观察到一些局限性。与抗原一起孵育的血清的最终稀释度无法调整,以产生组合在单个孔中的每个自身抗体测定的最佳条件。观察到来自T1D患者的9个样本(9/1026)对特定自身抗体有假阴性结果。在7-Plex ECL测定中,7个假阴性是TPOA,2个是ThGA,但在单一ECL测定和RBA中都表现出高阳性结果(图2 和 3)。在所有9个样品进一步稀释后,它们在多重板上呈阳性。这个结果是由我们所说的“prozone”现象引起的。这种现象导致样品显示假阴性结果,因为高抗体滴度会影响抗原抗体晶格的形成。在设置多重检测时,对于每种联合自身抗体,建议对具有非常高滴度的样品进行预测试,以确定用于抗原孵育的血清的可选稀释度。或者,应选择具有类似优化条件的自身抗体检测以形成组合检测,从中对每种自身抗体获得最佳检测灵敏度和特异性。在本研究中,来自健康正常对照的7个样品(7/1022)在7-Plex测定中导致多种自身抗体的假阳性,但是在运行单个ECL测定和RBA(图2 和 3)后,发现这些自身抗体在两种测定中均为阴性。对于这些小样本子集,多重平板上发生这些假阳性结果的原因目前尚不清楚。对于多重ECL检测的当前应用,所有阳性样品都重复其相应的单一ECL检测以确认阳性,从而消除了多重ECL检测中的假阳性误差。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH拨款DK32083,JDRF拨款2-SRA-2015-51-Q-R和2-SRA-2018-533-S-B的支持。
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac – Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
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