Vi modellerer et simpelt multiplekset ECL-assay, der kombinerer 7 autoantistofassays sammen. Analysen er i stand til at screene for T1D og flere andre autoimmune sygdomme samtidigt, herunder cøliaki, autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom og autoimmun polyglandulært syndrom 1.
Islet autoantistoffer (IAbs) anvendes i vid udstrækning i type 1-diabetes (T1D) diagnose og forudsigelse. Fire store IAb’er til insulin (IAA), glutamat decarboxylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og zinktransportør-8 (ZnT8A) er lige så vigtige i sygdomsforudsigelse. I øjeblikket fortsætter op til 40% af patienterne diagnosticeret med T1D med at udvikle andre autoimmune lidelser. Desværre er de nuværende screeningsmetoder, der bruger et enkelt autoantistof til måling, besværlige og ineffektive til store screeningsundersøgelser. Vi har for nylig udviklet et simpelt multiplekset elektrokemiluminescens (ECL) assay for at løse disse aktuelle problemer. Analysen kombinerer alle 7 autoantistoftest i en brønd. Hvert brønd indeholder tre IAbs (IAA, GADA og IA-2A), autoantistoffer mod skjoldbruskkirtelperoxidase (TPOA) og skjoldbruskkirtelglobulin (ThGA) til påvisning af autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom, autoantistoffer til vævstransglutaminase (TGA) til cøliaki og autoantistoffer til interferon alfa (IFNαA) til autoimmun polyglandulært syndrom-1 (APS-1); som alle screener for T1D og andre relevante autoimmune sygdomme samtidigt. Multiplex ECL-analysen er baseret på den enkelte ECL-analyseplatform, men bruger i stedet multiplexpladen, der kombinerer flere autoantistofassays, op til 10, i en enkelt brønd. Hovedforskellen fra det enkelte ECL-assay er, at hvert antistof-antigenkompleks dannet i væskefasen fastholdes på et bestemt sted på hver brønd gennem et linkersystem på multiplexpladen. 7-Plex ECL-assayet i denne undersøgelse er valideret mod standard radiobindingsassays (RBA) og enkelte ECL-assays ved hjælp af en stor kohorte af nydiagnosticerede T1D-patienter og aldersmatchede sunde kontroller, hvilket resulterer i fremragende analysefølsomhed og specificitet.
Type 1-diabetes (T1D) er en alvorlig kronisk sygdom, der er mest almindelig i barndommen. I øjeblikket har omkring 1,4 millioner mennesker T1D i USA; Det er påfaldende, at forekomsten af T1D stiger støt med 3-5% hvert år på verdensplan og er fordoblet i de sidste to årtier, især hos små børn 1,2. Isole autoantistoffer (IAbs) i blodcirkulationen er den mest pålidelige biomarkør på nuværende tidspunkt. IAbs kan forekomme år før klinisk T1D udvikler3. I øjeblikket anvendes fire store IAb’er i vid udstrækning i T1D-diagnose og risikoscreening, herunder autoantistoffer mod insulin (IAA), glutamatdecarboxylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og zinktransportør-8 (ZnT8A). Disse fire IAb’er er lige vigtige for forudsigelsen af T1D-udviklingen. Klassificeringen af T1D er for nylig blevet omdefineret som tilstedeværelsen af ≥2 af alle 4 IAbs med en normal glukosemetabolisme som sygdomsstadie 14.
I Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) blev det afsløret, at et ud af fire børn med risiko for T1D sandsynligvis ville udvikle sig til ø, cøliaki, skjoldbruskkirtel eller reumatoid autoimmunitet, og mere slående udvikler ca. 40% af patienterne, der er blevet diagnosticeret med T1D, til sidst en yderligere autoimmun tilstand 5,6,7 . Identifikation af autoantistoffer er afgørende for forudsigelse og diagnosticering af disse autoimmune sygdomme og bør give bedre klinisk pleje til patienter. Der er ingen nem og billig måde på nuværende tidspunkt at screene for disse mange autoimmune tilstande. Nuværende screeningsmetoder ved hjælp af standard radiobindingsassay (RBA) med en enkelt autoantistofmåling er besværlige og ineffektive til en storstilet screening.
Her vil vi beskrive det nyudviklede enkle multipleksede ECL-assay, som vi har godkendt ved hjælp af en enkelt ECL-analyseplatform 8,9,10,11. Multiplex ECL-analysen kombinerer 7 autoantistoftest i en enkelt brønd ved kun at bruge 15 μL serum og er i stand til at screene for T1D og flere relevante autoimmune sygdomme samtidigt, herunder cøliaki, autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom og APS-1. Et ZnT8A ECL-assay var ikke blevet udviklet på det tidspunkt og var ikke inkluderet i det multipleksede assay. Multiplex ECL-analysen giver et fremragende værktøj til høj gennemstrømning i generel befolkningsscreening for T1D og flere autoimmune sygdomme.
I adskillige nationale og internationale kliniske forsøg med type 1-diabetes er udførelsen af det enkelte ECL-assay til påvisning af ø-autoantistoffer og autoantistoffer mod transglutaminase (TGA) for cøliaki blevet dokumenteret 8,9,10,11. I løbet af disse stier har dette assay øget følsomheden og specificiteten for autoantigendetektion, når den vurderes i forhold til den eksisterende ‘guld’ standard RBA. Den forbedrede sygdomsspecificitet kan ses, når der skelnes mellem autoantistoffer med høj affinitet og høj risiko fra lavrisikosignaler med lav affinitet mellem det enkelte ECL-assay og RBA14,15,16,17. Med udgangspunkt i det enkelte ECL-assay udgør vi et nyt højt gennemstrømningsmultiplekset ECL-autoantistofassay, så vi kan screene for T1D samt flere relevante autoimmune sygdomme på samme tid.
Multiplex ECL-analysen bruger multiplexpladen, som kan kombinere op til 10 autoantistofassays i en enkelt brønd. Til denne undersøgelse kombineres 7 autoantistofassays sammen. Autoantistofferne består af 3 IAbs (IAA, GADA og IA-2A), 2 autoimmune skjoldbruskkirtelsygdomsautoantistoffer (TPOA og ThGA), cøliaki autoantistoffer (TGA) og APS-1 autoantistoffer til interferon alfa (IFNαA). Analysemekanismen er generelt baseret på et enkelt ECL-assay som tidligere offentliggjort 9,10,12,18 med nogle ændringer. Hovedforskellen i et multiplex ECL-assay fra et enkelt ECL-assay er, at hvert antistof-antigenkompleks dannet i væskefasen fastholdes til en specifik linker (figur 1). Det biotinmærkede antigen inkuberes med Streptavidin-konjugeret, en linker, der bruges til at danne et specifikt antigen-linkerkompleks. Antistof-antigen immunkompleks dannes efter inkubation med patientserum og fanges på et bestemt sted gennem det specifikke linkersystem på hver brønd i multiplexpladen. Ru Sulfo-NHS mærket antigen fanget af antistoffer på samme tid giver signalet med elektrokemiluminescens. Pladelæsermaskinen kan registrere op til 10 forskellige signaler fra spotkilderne i hver brønd. For at holde autoantistofassays konsistente mellem plader og under udførelse af langsigtede undersøgelser foreslår vi, at den samme linker anvendes.
Før der oprettes et multiplex ECL-assay, skal enkelte ECL-assays for hvert autoantistof optimeres på henholdsvis en multiplexplade og valideres mod både RBA- og enkelt ECL-assays på en almindelig ECL-plade. For at forbedre skakbrætassayet blev der anvendt en høj positiv patient og en negativ patientprøve til det relaterede autoantistofassay på multiplexpladen. Efter at skakbrætanalysen blev udført, blev de mest ideelle koncentrationer for Ru Sulfo-NHS og biotinmærket antigen beregnet for hvert af de 7 autoantistofassays. Følgende viser disse koncentrationer: 30 ng/ml og 200 ng/ml for GAD65, 120 ng/ml og 120 ng/ml for proinsulin, 10 ng/ml og 42 ng/ml for IA-2, 80 ng/ml og 80 ng/ml for TG, 8 ng/ml og 16 ng/ml for TPO, 31 ng/ml og 31 ng/ml for ThG og henholdsvis 12 ng/ml og 12 ng/ml for IFNα13. Koncentrationerne af nogle af antigenerne fra skakbrætassayet skal muligvis justeres yderligere i henhold til resultaterne i det faktiske multiplexassay efter at have kombineret alle assays sammen.
Da IAS er inkluderet i det nuværende multiplex ECL-assay, er syrebehandling af serumprøver obligatorisk, før serumet inkuberes med antigen, som rapporteret i den tidligere undersøgelse12. Generelt, når et ekstra autoantistof tilsættes til et multiplexassay, påvirkes analysebaggrunden, og et ekstremt højt signal fra et sted i brønden kan hindre resultaterne af nærliggende pletter via krydstale. Derfor skal den maksimale CPS begrænses til 20.000 tællinger for hvert autoantistof eller lavere for de højeste positive prøver. Fra vores viden bør autoantistoffer, der har en lavere baggrund, adskilles ved udformningen af spotkortet langt fra pletter med en højere frekvens af tællinger for at reducere mængden af krydstale.
Høje positive og negative kontroller blev brugt internt i hvert assay til at beregne et nøjagtigt indeks for de ukendte prøver, der blev testet. For nøjagtigt at vurdere og overvåge analysens følsomhed blev der anvendt lave positive kontroller, der var indstillet nær analysens øvre grænse. Disse standard positive og negative kontroller blev oprettet i bulk og aliquot til langvarig brug og opbevaret ved -20 °C eller derunder for at sikre overensstemmelse mellem assays. Af hensyn til kvalitetssikring blev prøverne kørt to gange i hvert assay, og hvert positivt resultat blev gentaget og bekræftet ved at køre prøven i et nyt ECL-assay den næste dag. Hvis der var uenighed med det første og andet bekræftende assay, var et tredje assay nødvendigt. Af de tre udførte assays bestemte resultaterne af de to assays, der var enige (f.eks. +, + eller -,-), det endelige resultat (positivt eller negativt) af prøven.
I det sidste årti søger mange studiegrupper et assay med høj gennemstrømning ved hjælp af multiplexmetoden til at kombinere flere autoantistofassays sammen til en brønd for at screene store populationer. Der er et par undersøgelser, der bruger forskellige typer teknologier til at udføre multiplex autoantistofassays 19,20,21,22, men der er ingen sammenligning for nogen af disse assays i følsomhed og specificitet mod den nuværende ‘guld’ standard RBA, når man studerer T1D. Disse forskellige typer platforme, der anvendes, valideres ikke gennem det internationale Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) værksted eller gennem test af store kohorter i kliniske forsøg. I en nylig generel befolkningsbaseret screening i Tyskland bruges et kombineret assay med høj kapacitet, 3 Screen ICATM ELISA distribueret af Kronus, som et værktøj til første linjescreening til at detektere tre IAbs, GADA, IA-2A og ZnT8A, for at opnå tidlig diagnose af barndoms T1D23. ELISA-analysen med 3 skærme måler 3 autoantistoffer enten i 3 adskilte brønde, der indtager et stort volumen serum, eller i en enkelt brønd med alle 3 assays blandet. Hvis en brønd i ELISA-analysen med 3 skærme er positiv, er man ikke i stand til at skelne mellem, hvilket af tre autoantistoffer der er til stede. Den største ulempe ved dette assay er dets manglende evne til at inkludere IAA-måling. Alle IAA-resultater udført af ELISA, som bevist i IASP-workshops, har ikke en acceptabel følsomhed og specificitet24. IAA er normalt den første IAb, der vises og har en høj forekomst blandt små børn. IAb-screening med IAA er nødvendig for børn, og det anses ikke for acceptabelt at foretage denne screening uden IAA for at vurdere T1D-risikoen i samfundet. Derudover er der ingen offentliggjorte undersøgelser eller data, der viser, at Kronus IAb-kit-analysen er mere T1D-sygdomsspecifik og i stand til at diskriminere høj risiko fra lavrisiko IAbs. 7-Plex ECL-analysen i denne undersøgelse blev valideret ved hjælp af en stor kohorte af nydiagnosticerede patienter med T1D13. Sammenlignet med den nuværende standard RBA og veletableret enkelt ECL-assay er 7-Plex-analysen i stand til at bevare 100% positivitet med samme assayspecificitet (tabel 4). I øjeblikket anvendes 4-Plex ECL-analysen parallelt med standard RBA på et igangværende stort klinisk forsøg: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) -undersøgelse. Dette forsøg screener børn i den generelle befolkning, i Denver hovedstadsområdet, for T1D og cøliaki. Sammenlignet med standard RBA, der blev brugt i ASK-undersøgelsen, viser multiplex ECL-analysen fremragende følsomhed og en højere sygdomsspecificitet, identisk med vores tidligere rapporter ved hjælp af den enkelte ECL-undersøgelse25. Desuden viste vores 4-Plex ECL-assay en markant reduktion i arbejdskraft, omkostninger og serumvolumen med 70% sammenlignet med de tilsvarende 4 enkeltassays for ECL og RBA. Ved hjælp af det multipleksede ECL-assay kan vi tilpasse hver brønd med forskellige tal, der repræsenterer forskellige autoantistoffer (op til 10), for at teste for forskellige autoimmune sygdomme, der er specifikke for behovene på et bestemt klinisk sted.
Der er observeret nogle begrænsninger, vist i denne undersøgelse, for et multiplekset ECL-assay ved hjælp af multiplexpladen. Den endelige fortynding af serum, inkuberet med antigen, kan ikke justeres for at give de mest optimale betingelser for hvert enkelt autoantistofassay, der kombineres i en enkelt brønd. Ni prøver (9/1026) fra T1D-patienter blev observeret at have et falsk negativt resultat for bestemte autoantistoffer. 7 af de falske negativer var for TPOA og 2 var for ThGA, i 7-Plex ECL-analysen, men høje positive resultater blev udstillet i både det enkelte ECL-assay og RBA (figur 2 & 3). Efter yderligere fortynding af alle 9 prøver blev de positive på multiplexpladen. Dette resultat skyldes, hvad vi beskriver som fænomenet ‘prozone’. Dette fænomen får prøven til at vise et falsk negativt resultat, fordi de høje antistoftitre påvirker dannelsen af antigen-antistofgitter. Ved opstilling af et multiplexassay anbefales det at få foretaget prøver med meget høje titere for hvert af de kombinerede autoantistoffer for at få foretaget forprøver for at identificere den valgfri fortynding af serum til antigeninkubation. Alternativt bør autoantistofassays med lignende optimerede betingelser vælges til at danne et kombineret assay, hvorfra den bedste assayfølsomhed og specificitet opnås for hvert autoantistof. I denne undersøgelse resulterede 7 prøver (7/1022) fra sunde normale kontroller i falske positive for flere autoantistoffer i 7-Plex-analysen, men efter at have kørt et enkelt ECL-assay og RBA (figur 2 & 3) viste disse autoantistoffer sig at være negative i begge assays. Årsagerne til disse falske positive resultater, der forekommer på multiplexpladen, for disse små delmængder af prøver, er i øjeblikket ukendte. For den nuværende anvendelse af multiplex ECL-analysen gentages alle positive prøver med deres tilsvarende enkelt ECL-assay for at bekræfte positivitet, hvilket fjerner denne falske positive fejl fra multiplex ECL-assayet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH-bevilling DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R og 2-SRA-2018-533-S-B.
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac – Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
ZeBa Column | Pierce | 89892 |