Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires
Summary
Décrit ici est un protocole pour étudier comment l’extrait de fumée de cigarette affecte la colonisation bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires.
Abstract
Le tabagisme est la principale cause étiologique de l’emphysème pulmonaire et de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Le tabagisme favorise également la susceptibilité aux infections bactériennes dans le système respiratoire. Cependant, les effets du tabagisme sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines n’ont pas encore été étudiés en profondeur. Décrit ici est un protocole détaillé pour la préparation des extraits de tabagisme (CSE), le traitement des cellules épithéliales pulmonaires humaines avec CSE, et l’infection bactérienne et la détermination de l’infection. Le CST a été préparé selon une méthode conventionnelle. Les cellules épithéliales pulmonaires ont été traitées avec 4% de CSE pour 3 h. Les cellules traitées au CSE ont alors été infectées par Pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les charges bactériennes des cellules ont été déterminées par trois méthodes différentes. Les résultats ont montré que le CSE a augmenté la charge de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Ce protocole fournit donc une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.
Introduction
Le tabagisme affecte la santé publique de millions de personnes dans le monde. De nombreuses maladies nocives, y compris le cancer du poumon et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), seraient liées au tabagisme1,2. Le tabagisme augmente la susceptibilité aux infections microbiennes aiguës dans le système respiratoire3,4,5. En outre, les preuves de montage prouvent que le tabagisme améliore la pathogénie de nombreux troubles chroniques6,7,8. Par exemple, le tabagisme peut augmenter les infections virales ou bactériennes qui causent l’exacerbation de la MPOC9. Parmi les pathogènes bactériens qui contribuent étiologiquement à l’exacerbation aiguë de la MPOC, un pathogène gramme-négatif opportuniste bacillus, Pseudomonas aeruginosa, provoque des infections qui se corrélent avec de faibles pronostics et des mortalités plus élevées10,11. L’exacerbation de la MPOC aggrave la maladie en accélérant la progression pathologique. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre l’exacerbation de la MPOC, à l’exception de la prise en charge antisymptomatique12. L’exacerbation de la MPOC favorise la mortalité des patients, diminue la qualité de vie et augmente le fardeau économique pour la société13.
Les voies respiratoires sont un système ouvert, continuellement soumis à divers agents pathogènes microbiens présents à l’extérieur. Des agents pathogènes bactériens opportunistes sont habituellement détectés dans les voies respiratoires supérieures, mais sont parfois observés dans les voies respiratoires inférieures14,15. Dans les modèles animaux P. aeruginosa peut être détecté dans les sacs alvéolaires dès 1 h après l’infection16. En tant que mécanisme de défense majeur, les cellules immunitaires telles que les macrophages ou les neutrophiles éliminent les bactéries dans les voies respiratoires. Les cellules épithéliales pulmonaires, en tant que première barrière physiologique, jouent un rôle unique dans la défense de l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules épithéliales pulmonaires peuvent réguler l’invasion microbienne, la colonisation ou la réplication indépendamment des cellules immunitaires17. Certaines molécules présentes dans les cellules épithéliales, y compris PPARg, exercent des fonctions antibactériennes, régulant ainsi la colonisation bactérienne et la réplication dans les cellules épithéliales pulmonaires18. Le tabagisme peut altérer les molécules et altérer la fonction de défense normale dans les cellules épithéliales pulmonaires19,20. Des études récentes ont rapporté l’exposition directe de la fumée de cigarette aux cellules épithéliales de poumon utilisant l’appareil de tabagisme de robot21,22. Toutefois, l’exposition à la fumée peut être effectuée d’autres façons, y compris l’application du CST. La préparation du CST est une approche reproductible avec des applications potentielles dans d’autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales vasculaires qui sont indirectement exposées à la fumée de cigarette.
Ce rapport décrit un protocole pour générer l’extrait de fumée de cigarette pour modifier la charge bactérienne dans les cellules épithéliales de poumon. CST augmente la charge bactérienne de P. aeruginosa, et il peut contribuer à la récurrence des infections bactériennes habituellement observées dans l’exacerbation de la MPOC. Une méthode conventionnelle est utilisée pour la préparation du CST. Les cellules épithéliales pulmonaires, à leur stade de croissance exponentielle, sont traitées avec 4% de CST pendant 3 h. Alternativement, les cellules épithéliales pulmonaires de culture monocouche peuvent être directement exposées à la fumée de cigarette dans une interface air-liquide. Les cellules traitées au CSE sont ensuite défiées avec pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les bactéries sont propagées à une vitesse de secousse particulière pour s’assurer que la morphologie de leur flagelle reste intacte pour conserver leur pleine capacité invasive. La gentamycine est utilisée pour tuer les bactéries laissées dans le milieu de culture, réduisant ainsi la contamination potentielle pendant la détermination ultérieure de la charge bactérienne. Le protocole utilise également pseudomonasétiqueté GFP , qui a été utilisé comme un outil puissant dans l’étude de l’infection Pseudomonas dans différents modèles. Une souche représentative est P. fluorescens Migula23. Le degré d’infection ou de charge bactérienne après le traitement du CST est déterminé de trois façons : la méthode de la plaque de chute avec le comptage des colonies, le PCR quantitatif à l’aide d’amorces spécifiques à pseudomonas 16S, ou la cytométrie de flux dans les cellules infectées par des pseudomonas fluorescents. Ce protocole est une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’invasion bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires est une étape cruciale dans la pathogénie des infections bactériennes. Le processus d’invasion bactérienne dans les cellules peut être divisé en trois étapes suivantes: Premièrement, les bactéries entrent en contact et adhèrent à la surface de la cellule épithéliale à l’aide de leur flagelle. Deuxièmement, les bactéries subissent une internalisation ou pénètrent dans la membrane cellulaire. Enfin, les bactéries reproduisent et c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par un National Institutes of Health R01 subventions HL125435 et HL142997 (à CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
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