肺上皮細胞における シュードモナス 感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

Summary

ここで説明する、タバコの煙抽出物が肺上皮細胞における細菌のコロニー形成にどのように影響するかを研究するプロトコルである。

Abstract

タバコの喫煙は肺肺気腫や慢性閉塞性肺疾患(COPD)の主要な病因である。タバコの喫煙はまた、呼吸器系における細菌感染に対する感受性を促進する。しかし、タバコの喫煙がヒト肺上皮細胞の細菌感染に及ぼす影響は、まだ十分に研究されていない。ここで説明するのは、タバコ喫煙抽出物(CSE)の調製、ヒト肺上皮細胞のCSEによる治療、および細菌感染および感染判定の詳細なプロトコルである。CSEは、従来の方法で調製した。肺上皮細胞は、CSE処理細胞を3hに対して4%CSEで処理し、その後、10の多重性の感染(MOI)で シュードモナス に感染した。細胞の細菌負荷は、3つの異なる方法によって決定した。その結果、CSEは肺上皮細胞における シュードモナス 負荷を増加させる。したがって、このプロトコルは、肺上皮細胞における細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチを提供する。

Introduction

タバコの喫煙は、世界中の何百万人もの人々の公衆衛生に影響を与えます。肺癌や慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む多くの有害性疾患は、タバコの喫煙^11,22に関連していると報告されている。タバコの喫煙は、呼吸器系^,3、4、54における急性微生物感染に対する³感受性を高める。⁵さらに、取り付け証拠は、タバコの喫煙が多くの慢性疾患^{66、7、87,8}の病因を高めることを証明する。例えば、タバコの喫煙は、COPDの悪化を引き起こすウイルスまたは細菌感染を増加させる可能性があります⁹.COPDの急性増悪に病因となる細菌病原体の中で、日和見グラム陰性バチルス病原体である緑膿菌は、予後不良および死亡率の高い^10,11,11と相関する感染症を引き起こす。COPD増悪は病理学的進行を加速することによって病気を悪化させる。COPDの悪化に対する有効な治療法は、抗無症候性管理¹²を除いてはない。COPDの悪化は患者の死亡率を促進し、生活の質を低下させ、社会¹³の経済的負担を増大させる。

呼吸器気道は開放系であり、外部に存在する種々の微生物病原体に連続的に供される。日和見細菌病原体は、通常、上気道で検出されるが、時には下気道^14、15,15で観察される。動物モデルではP.緑素吸虫は、感染¹⁶後1時間と速やかに肺胞嚢で検出することができる。主要な防御機構として、マクロファージや好中球などの免疫細胞は、気道内の細菌を排除する。肺上皮細胞は、第1の生理学的障壁として、微生物感染に対する宿主防御において独特の役割を果たす。肺上皮細胞は、免疫細胞¹⁷から独立した微生物の浸潤、コロニー形成、または複製を調節することができる。PPARgを含む上皮細胞に見られるいくつかの分子は、抗菌機能を発揮し、それによって肺上皮細胞¹⁸における細菌コロニー形成および複製を調節する。タバコの喫煙は、分子を変化させ、肺上皮細胞^19,20,20における正常な防御機能を損なう可能性がある。最近の研究では、ロボット喫煙装置^21,22を用いて肺上皮細胞へのタバコの煙の直接暴露^が22報告された。しかし、煙への暴露は、CSEの適用を含む他の方法で行うことができます。CSEの調製は、間接的にタバコの煙にさらされている血管内皮細胞を含む他の細胞タイプの潜在的な用途を有する再現可能なアプローチである。

本報告書は、肺上皮細胞の細菌負荷を変化させるタバコの煙抽出物を生成するプロトコルについて説明する。CSEは 、緑内科の細菌負荷を増加させ、COPD悪化に通常見られる細菌感染の再発に寄与する可能性がある。CSEの調製には、従来の方法が使用されます。肺上皮細胞は、その指数成長段階で、3時間の4%CSEで処理される。あるいは、単層培養肺上皮細胞は、空気液体界面でタバコの煙に直接曝すことができる。CSE処理細胞は、その後、10の感染の多重性(MOI)で シュードモナス で挑戦されます。細菌は、そのフラゲラの形態が完全な侵襲能力を保持するためにそのまま残っていることを確認するために、特定の揺れの速度で伝播されます。ゲンタマイシンは、培養培地に残された細菌を殺すために採用され、それにより、細菌負荷のその後の判定時に潜在的な汚染を低減する。このプロトコルはまた、さまざまなモデルで シュードモナス感染を研究する強力なツールとして利用されているGFPラベル付き シュードモナスを 使用しています。代表的な株は 、P.フルオレセンの ミグラ²³です。CSE治療後の感染性または細菌負荷の程度は、コロニー計数を伴うドロッププレート法、 シュードモナス 16S rRNA特異的プライマーを用いた定量PCR、または蛍光 シュードモナスに感染した細胞におけるフローサイトメトリーの3つの方法で決定される。このプロトコルは、肺上皮細胞の細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチです。

Protocol

1. 100% CSEの準備 10 mL の無血清細胞培養培地(BeAS-2B 細胞の DMEM/F12、HSAEC 細胞用の気道上皮細胞基底培地)を 60 mL シリンジに引き出します。 適切にトリミングした1mLピペットチップをシガレット(3R4F)を保持するアダプターとしてシリンジのノズルに取り付けます。 タバコのフィルターを取り外します。チップアダプターにタバコを取り付け、タバコを燃焼させます。 <l…

Representative Results

図を使用して、図 1にプロトコルを示します。肺上皮BEAS-2B細胞はCSEで治療され、シュードモナスで挑戦した。培地中のシュードモナスを添加したゲンタマイシンによって殺され、細胞はドロッププレートアッセイ、シュードモナスリボソーム16S RNAのRT-qPCR検出、およびフローサイトメトリーを行った。対照と比較して、CSE治療は、ドロッププレート?…

Discussion

肺上皮細胞への細菌の侵入は、細菌感染の病因における重要なステップである。細菌の細胞への侵入のプロセスは、次の3つのステップに分けることができます:まず、細菌が接触し、それらのフラゲラを使用して上皮細胞の表面に付着します。第二に、細菌は内在化を受けるか、細胞膜に浸透する。最後に、細菌は細胞防御機構^25,26を正常に脱出すれば細胞を複製^{し、</su…}

Materials

50mL syringe	BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium	ATCC	PCS-300-030
Bacteria shaker	ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit	ATCC	PCS-300-040
Cell Counter	Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System	Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT	ThermoFisher Scientific	4387406
HITES medium	ATCC	ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells	ATCC	ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells	ATCC	ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer	BD Biosciences
Nikkon confocal microscope	Nikkon
OD reader	USA Scientific
PCR primers	ITD
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC 47085	PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula	ATCC	ATCC 27853	P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F)	University of Kentucky	TP-7-VA
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Transprent PET Transwell Insert	Corning Costar
Tryptic Soy Broth	BD Biosciences