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면역학 및 감염병학

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Abstract

O sistema nervoso central (SNC) é composto pelo cérebro e pela medula espinhal e é envolto pelas meninges, camadas membranosas que servem de barreira entre a periferia e o SNC. O SNC é um sítio imunologicamente especializado e, em condições de estado estacionário, o privilégio imunológico é mais evidente no parênquima do SNC. Em contraste, as meninges abrigam uma gama diversificada de células residentes, incluindo células imunes inatas e adaptativas. Durante condições inflamatórias desencadeadas por lesão do SNC, autoimunidade, infecção ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia podem entrar no parênquima e se instalar dentro das meninges. Acredita-se que essas células realizem ações benéficas e prejudiciais durante a patogênese da doença do SNC. Apesar desse conhecimento, as meninges são frequentemente negligenciadas quando se analisa o compartimento do SNC, pois os métodos convencionais de extração tecidual do SNC omitem as camadas meníngeas. Este protocolo apresenta dois métodos distintos para o isolamento rápido de tecidos murinos do SNC (isto é, cérebro, medula espinhal e meninges) que são adequados para análise a jusante através de técnicas de célula única, imunohistoquímica e métodos de hibridização in situ. Os métodos descritos fornecem uma análise abrangente dos tecidos do SNC, ideal para avaliar o fenótipo, a função e a localização das células que ocupam o compartimento do SNC sob condições homeostáticas e durante a patogênese da doença.

Introduction

O sistema nervoso central (SNC) é um sítio imunologicamente especializado. O parênquima do SNC, excluindo o espaço liquórico, as meninges e a vasculatura, é classicamente visto como um sítio imunoprivilegiado 1,2,3,4,5 e é relativamente desprovido de células imunes durante condições homeostáticas2,6,7. Em contraste, as meninges, compostas pelas camadas dura, aracnoide e pia, são componentes cruciais do compartimento do SNC, participando ativamente da vigilância imunológica homeostática e dos processos inflamatórios durante a patogênese da doença 3,6,7,8. Durante condições de estado estacionário, as meninges suportam numerosas células sentinelas imunes, incluindo células linfoides inatas (ILC), macrófagos, células dendríticas (DC), mastócitos, células T e, em menor grau, células B 9,10,11.

As meninges são estruturas altamente vascularizadas e contêm vasos linfáticos que fornecem uma conexão linfática entre o SNC e sua periferia8,12,13,14. Em condições inflamatórias induzidas por lesão do SNC, infecções, autoimunidade ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia infiltram o parênquima e alteram a paisagem imune dentro das meninges. Após a infiltração celular, as meninges podem representar um nicho funcional para células imunes derivadas da periferia, promovendo agregação de células imunes, ativação de células imunes locais e sobrevivência a longo prazo no compartimento do SNC. Inflamação meníngea proeminente é observada em múltiplas doenças que afetam o SNC, incluindo esclerose múltipla (EM)15,16,17,18,19, acidente vascular cerebral 20,21, lesão estéril 22,23 (i.e., lesão medular e traumatismo cranioencefálico), enxaqueca 24 e infecção microbiana 25,26,27,28,29. Assim, a caracterização de células residentes e células imunes derivadas periféricas no compartimento meníngeo é essencial para a compreensão do papel dessas células durante condições de estado estacionário e patogênese da doença.

A extração do cérebro, medula espinhal e meninges do crânio e corpos vertebrais é tecnicamente desafiadora e demorada. Atualmente, não há técnicas disponíveis para a extração rápida do cérebro com as três camadas meníngeas intactas. Embora a laminectomia produza excelente morfologia do tecido medular e preserve as camadas meníngeas, é extremamente demorada e complicada30,31. Por outro lado, métodos de extração mais convencionais, como a remoção do cérebro do crânio e a extrusão hidráulica da medula espinhal, facilitam a rápida extração do tecido do SNC, mas tanto a meninge aracnoide quanto a dural são perdidas com essas técnicas30,31. A omissão das camadas dura-máter e aracnoide durante o isolamento convencional dos tecidos do cérebro e da medula espinhal resulta em uma análise incompleta das células dentro do compartimento do SNC. Assim, a identificação de novas técnicas focadas na extração rápida de tecidos do SNC com meninges intactas é crucial para a análise ótima do compartimento do SNC.

Este manuscrito apresenta dois métodos para a extração rápida do cérebro, medula espinhal e meninges de camundongos, facilitando a análise a jusante de células residentes e células imunes derivadas da periferia no parênquima do SNC e meninges. Esses protocolos otimizados concentram-se em 1) isolar suspensões unicelulares para análise a jusante e 2) preparar o tecido para processamento histológico. A obtenção de suspensões unicelulares do cérebro, tecido medular e meninges durais e aracnoides32 permite a análise simultânea de células residentes nos compartimentos parenquimatoso e meníngeo. Suspensões unicelulares podem ser usadas em diferentes aplicações, incluindo ensaios de cultura celular para realizar estimulação in vitro 33, imunospot ligado à enzima (ELISpot)28,34,35, citometria de fluxo 36,33 e transcriptômica de célula única 37 ou em massa. Além disso, o protocolo otimizado para descalcificação de cérebros inteiros e medula espinhal com crânios ou colunas vertebrais intactos, respectivamente, permite a descalcificação suave do osso circundante, deixando as meninges intactas e preservando a morfologia tecidual. Este método permite a identificação seletiva de proteínas ou RNA usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) ou hibridização in situ (HIS) dentro dos espaços parenquimatoso e meníngeo. A caracterização do fenótipo, estado de ativação e localização de células residentes e células imunes derivadas periféricas dentro do SNC pode fornecer informações essenciais para a compreensão de como tipos celulares individuais no compartimento do SNC contribuem para a homeostase e patogênese da doença.

Protocol

Todo trabalho com animais utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina Geisel de Dartmouth. 1. Processamento de amostras de cérebro e medula espinhal para descalcificação Isolamento de amostras de cérebro e medula espinhal Eutanásia do rato por inalação de CO2 . Certifique-se de que a taxa de fluxo de CO2 desloca de 10% a 30% do volume da gaiola por…

Representative Results

Este experimento representativo teve como objetivo quantificar as células B e T e descrever a localização das células B e T nos compartimentos meníngeo e parenquimatoso do SNC em condições homeostáticas, bem como em um modelo murino de EM progressiva (i.e., IDD-TMEV). O DDI-TMEV foi induzido em camundongos SJL fêmeas com 5 semanas de idade por infecção intracraniana com 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn, conforme descrito anteriormente29. <p class="j…

Discussion

Métodos para avaliar a composição celular no compartimento do SNC durante a homeostase e a doença são essenciais para a compreensão dos estados fisiológicos e patológicos do SNC. No entanto, apesar de servir como uma barreira importante no SNC e abrigar uma gama diversificada de células imunes, as meninges são frequentemente omitidas da análise porque muitos métodos convencionais de extração de tecidos para o cérebro e a medula espinhal não permitem a coleta dessas membranas. Essa omissão é uma limitaç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina Comparada e Pesquisa (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. O Bornstein Research Fund financiou esta pesquisa.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
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