In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para realizar manipulação genética no cérebro de furão embrionário usando na eletroporação uterónica. Este método permite o direcionamento de células progenitoras neurais no neocórtex in vivo.
Abstract
A manipulação da expressão genética in vivo durante o desenvolvimento embrionário é o método de escolha ao analisar o papel dos genes individuais durante o desenvolvimento dos mamíferos. No útero a eletroporação é uma técnica-chave para a manipulação da expressão genética no cérebro embrionário mamífero in vivo. Um protocolo para a eletroporação uterópica do neocórtex embrionário de furões, um pequeno carnívoro, é apresentado aqui. O furão está cada vez mais sendo usado como modelo para o desenvolvimento do neocórtex, pois seu neocórtex exibe uma série de características anatômicas, histológicas, celulares e moleculares que também estão presentes em primatas humanos e não humanos, mas ausentes em modelos de roedores, como rato ou rato. No útero a eletroporação foi realizada no dia embrionário (E) 33, um estágio de midneurogenesis no furão. No útero a eletroporação tem como alvo células progenitoras neurais que revestem os ventrículos laterais do cérebro. Durante a neurogênese, essas células progenitoras dão origem a todos os outros tipos de células neurais. Este trabalho mostra resultados e análises representativas no E37, no dia pós-natal (P) 1 e P16, correspondentes a 4, 9 e 24 dias após a eletroporação uterativa, respectivamente. Em estágios anteriores, a progênia das células-alvo consiste principalmente de vários subtipos progenitores neurais, enquanto em estágios posteriores a maioria das células rotuladas são neurônios pós-metóticos. Assim, na eletroporação uterópora permite o estudo do efeito da manipulação genética nas características celulares e moleculares de vários tipos de células neurais. Através de seu efeito em várias populações celulares, na eletroporação uterópica também pode ser usado para a manipulação de características histológicas e anatômicas do neocórtex furão. É importante ressaltar que todos esses efeitos são agudos e são realizados com uma especificidade espostetorial determinada pelo usuário.
Introduction
O neocórtex é a folha externa do cerebrum mamífero e a sede de funções cognitivas mais altas1,,2,3,4,5. Para alcançar uma manipulação genética aguda no neocórtex mamífero in vivo durante o desenvolvimento embrionário, dois métodos diferentes foram explorados: infecção viral6 e na eletroporaçãouterónica 7. Ambos os métodos permitem um direcionamento eficiente de células neocorticais, mas sofrem de algumas limitações. A maior vantagem da eletroporação uteiremida em relação à infecção viral é a capacidade de alcançar especificidade espacial dentro do neocórtex, que é alcançado pela regulação da direção do campo elétrico.
Desde que a eletroporação foi mostrada pela primeira vez para facilitar a entrada de DNA nas células in vitro8,ela foi aplicada para entregar DNA em vários vertebrados in vivo. Na neurociência do desenvolvimento, a eletroporação utero do neocórtex do camundongo foi relatada pela primeira vez em 20019,10. Este método consiste em uma injeção da mistura de DNA no ventrículo lateral do cérebro embrionário e posterior aplicação do campo elétrico usando eletrodos de pinça, o que permite precisão espacial7,,11. A eletroporação utero tem sido aplicada desde então para fornecer ácidos nucleicos a fim de manipular a expressão de genes endógenos ou emplacados no neocórtex do camundongo. Importantes progressos foram feitos recentemente, aplicando a metodologia de edição de genoma mediado por CRISPR/Cas9 via eletroporação utero no neocórtex do camundongo para realizar (1) interrupção genética nos neurônios pós-metóticos12,,13 e células progenitoras neurais14, e (2) genoma15 e edição epigenome16.
Logo após o primeiro relato em camundongos, na eletroporação uterónica foi aplicado ao neocórtex de rato embrionário17,18. Os não roedores permaneceram um desafio até que a primeira eletroporação uterópica de furões, um pequeno carnívoro, foi relatada em 201219,20. Desde então, no útero a eletroporação de furões tem sido aplicada para estudar os mecanismos de desenvolvimento do neocórtex rotulando progenitores neurais e neurônios20,21,22,,23, manipulando a expressão de genes endógenos, incluindo o uso da tecnologia CRISPR/Cas924, e fornecendo genes ectópicos21,22,,25, incluindo genes humanos-específicos26. Além disso, a eletroporação utero de furões tem sido usada para abordar características do desenvolvimento do neocórtex humano em condições patológicas27,28.
No contexto do desenvolvimento do neocórtex, as vantagens de usar furões como organismo modelo em comparação com camundongos se devem ao fato de que os furões melhor recapitulam uma série de características humanas. No nível anatômico, os furões exibem um padrão característico de dobramento cortical, que também está presente no ser humano e na maioria dos outros primatas, mas está completamente ausente em camundongos ou ratos4,,29,,30,,31. No nível histológico, os furões têm duas zonas germinals subventriculares distintas, conhecidas como zonas subventriculares internas e externas (ISVZ e OSVZ,respectivamente) 32,33, separadas pela camada interna de fibra23. Essas características também são compartilhadas com primatas, incluindo humanos, mas não com camundongos34. O ISVZ e o OSVZ em furões e humanos são povoados com abundantes células progenitoras neurais, enquanto a zona subventricular (SVZ) de camundongos contém apenas progenitores neurais esparsos21,,32,,35,,36. A nível celular, os furões apresentam uma alta proporção de um subtipo de progenitores neurais referidos como glia radial basal ou externa (bRG ou oRG, respectivamente), que são considerados instrumentais para a expansão evolutiva do neocórtex mamífero34,,37,38. bRG são, portanto, altamente abundantes no neocórtex do furão humano e embrionário fetal, mas são muito raros no neocórtex do camundongo embrionário35,36. Além disso, o furão bRG apresenta heterogeneidade morfológica semelhante à do bRG humano, muito superior ao do mouse bRG21. Finalmente, em nível molecular, o desenvolvimento do neocórtex furão mostra padrões de expressão genética altamente semelhantes aos do neocórtex humano fetal, que presume-se controlar o desenvolvimento da dobra cortical, entre outras coisas39.
As características biológicas e moleculares das características biológicas e moleculares do furão bRG tornam-nas altamente proliferativas, semelhantes à bRG humana. Isso resulta em um aumento da produção de neurônios e desenvolvimento de um neocórtex expandido e altamente complexo34. Essas características tornam os furões excelentes organismos modelo para estudar características humanas do desenvolvimento de neocórtex que não podem ser modelados em camundongos26,40. Para aproveitar ao máximo o furão como organismo modelo, foi desenvolvido o método apresentado. Consiste na eletroporação uterópica de embriões furões furões E33 com um plasmídeo expressando GFP (pGFP) sob o controle de um promotor onipresente, CAG. Os embriões eletroporados podem então ser analisados embrionáriamente ou postalmente. Para reduzir o número de animais sacrificados, os furões fêmeas (jills) são esterilizados pela histerectomia e doados para adoção como animais de estimação. Se os embriões-alvo forem colhidos em estágios embrionários, uma segunda cirurgia é realizada e os embriões são removidos por cesariana, enquanto os jills são histerectomizados. Se os embriões-alvo forem analisados em estágios pós-natal, os jills são histerectomizados após os filhotes serem desmamados ou sacrificados. Por isso, também é apresentado um protocolo para a histerectomia dos jills.
Protocol
Representative Results
Discussion
No útero a eletroporação no furão é uma técnica importante, com vantagens e desvantagens em relação a outros métodos. Existem etapas e limitações críticas para este método, bem como possíveis modificações e aplicações futuras para ter em mente.
Desde o pioneirismo de Victor Borrell e colegas sobre manipulação genética do neocórtex do furão pós-natal via eletroporação ou injeção viral35,42,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos aos Serviços e Instalações do Instituto Max Planck de Biologia Celular Molecular e Genética pelo excelente apoio prestado, notadamente toda a equipe dos serviços biomédicos (BMS) pela excelente criação de furões e J. Peychl e sua equipe da Instalação de Microscopia Leve. Somos particularmente gratos a Katrin Reppe e Anna Pfeffer da BMS por apoio veterinário excepcional e Lei Xing do grupo Huttner por ajudar em cirurgias de furões.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
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