בידוד ותרבות של נוירונים ראשוניים גליה משלפוחית השתן של חולדה בוגרת
Summary
פרוטוקול זה מנסה לקבוע פרוטוקול חוזר עבור נוירונים ראשוניים ובידוד גליה מ שלפוחית השתן של חולדה לניסויים תאיים נוספים.
Abstract
בדרכי השתן התחתונות יש שתי פונקציות עיקריות, כלומר, אחסון שתן תקופתי ומיקרוביום; פונקציות אלה מתווכים באמצעות נוירורגולציה מרכזית והיקפית. למרות מחקר מקיף על מערכת העצבים בדרכי השתן התחתונה נערך, רוב המחקרים התמקדו בתרבות העיקרית. פרוטוקול זה מציג שיטה לבידוד ותרבות של נוירונים בשלפוחית השתן וגליה מעכברושי ספראג-דוולי. בשיטה זו, הנוירונים וגליה היו דגירה ב 37 °C (60 °F), 5% CO2 חממה במשך 5-7 ימים. כתוצאה מכך, הם גדלו לצורות בוגרות המתאימות לניסויים הקשורים לכשל חיסוני. תאים נצפו מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ אופטי. נוירונים, סינפטי סינפטי, גליה זוהו על ידי β-III-טובולין ו MAP-2, Synapsin-1, ו GFAP כתמים, בהתאמה. בינתיים, אימונוציטוכימיה בוצעה על מספר חלבונים הקשורים נוירוטרנסמיטר, כגון אצטילטרנספראז כולין, DYNLL2, ו SLC17A9.
Introduction
לדרכי השתן התחתונות יש שתי פונקציות עיקריות: אחסון שתן תקופתי ומיקרוביום1. מערכת העצבים בדרכי השתן התחתונות (LUTNS) שולטת בתפקודים אלה והיא עדינה וראויה לנוירופתיות רבות, אשר יכול להיות מולד (פורפיריה), רכש (מחלת ליים), משני למצבי מחלה (ציסטופתיה סוכרתית), סמים המושרה (דלקת שלפוחית השתן דימומית), ניתוח שנגרם (כריתה abdominoperineal), או פציעה הנגרמת (פגיעה טראומטית בחוט השדרה)2,3,4,5,6,7. במחקרים פיזיולוגיים/פתולוגיים, ניסויים in vivo ו במבחנה חשובים באותה מידה. בעוד מחקר vivo על LUTNS נערך ברמות איברים, הסלולר, מולקולרית במשך זמן מה, אין ויטרו מחקר על נוירונים ראשוניים משלפוחית השתן הוא כמעט לא קיים8,9. למרות שהמחקר הנוכחי מוגבל, אנו מקווים ל החלוץ במחקר בתחום זה, כך שחוקרים אחרים יוכלו לשפר אותו. באופן זה, תרבות משותפת זו עלולה להוביל להבנה תאית של תפקוד לקוי פיזיולוגי בפנוטיפים, כגון תפקוד לקוי של נוירון שלפוחית השתן.
בניגוד לשרירים אנטריים עם כיווניות ברורה של תאי השריר לשכבות נפרדות, שרירי שלפוחית השתן אינם מאורגנים10. לכן, במקום לקלף את השכבה החיצונית של שלפוחית השתן, שיטה זו מציעה לעכל את שלפוחית השתן כולה כדי להפחית את קושי הפעולה ולקצר את זמן עיבוד מראש לשיעור הישרדות תאים גבוה.
בעקבות שיטה זו, אנו יכולים להשיג תרבות מעורבת של נוירונים ותאים אחרים. התאים האחרים הם הכרחיים כי נוכחותם מחקה סביבת vivo11. בנוסף, תאים כאלה מספקים את החומרים שאינם זמינים במדיום.
שיטה זו כוללת שני שלבים לעיכול. ראשית, קולגנאז מסוג II משמש הידרוליזה קולגן, ואחריו טריפסין, כדי לנתק את הרקמה לתאים10. באופן זה, רקמות שלפוחית השתן מפוזרות לתאים בודדים ולאחר מכן לגדול עצמאי יחסית. כאשר התרבות של נוירונים מתבגרת, הנוירונים יכולים לשמש להדמיה או מבחנים פונקציונליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת צלחת
השימוש בכיסויי זכוכית בצלחות תרבות של 6, 12 או 48 בארות לניסויים אימונופלואורסצנטיים או הדמיית סידן הוא פעולה חסכונית וחוסכת מדגם. תאים גדלים היטב בצלחות ללא כיסויים במהלך הכנת תרביות תאים ראשוניות. לכן, כיסויים ניתנים לוותר בניסויים, כגון כתם מערבי או תגובת שרשרת פולימ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס ‘ 81673676) ולשכת המדע והטכנולוגיה של דונגגוואן (גרנט מס ‘ 2019622101002). המחברים מודים לד”ר מרירוז סאליבן (פרופסור לכירורגיה, בית הספר לרפואה של הרווארד) על ייעוץ טכני.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
