חסימת זרימת הלימפה על ידי תפירת כלי לימפה אפילנט בעכברים
Summary
פרוטוקול לחסום את זרימת הלימפה על ידי תפירה כירורגית של כלי לימפה שונים מוצג.
Abstract
כלי הלימפה הם קריטיים בשמירה על איזון נוזל רקמות אופטימיזציה של ההגנה החיסונית על ידי הובלת אנטיגן, ציטוקינים, ותאים לתעלות הלימפה ניקוז (LNs). הפרעה של זרימת הלימפה היא שיטה חשובה בעת לימוד הפונקציה של כלי לימפה. כלי הלימפה האדמטיים האדיבים ממשטח הרגליים של המריין ועד לבלוטות הלימפה הפופוליליות (pLNs) מוגדרות היטב בשם המסלולים היחידים לניקוז הלימפה לתוך ה-pLNs. תפירת כלי לימפה שונים אלה יכולה למנוע באופן סלקטיבי את זרימת הלימפה ל-pLNs. שיטה זו מאפשרת הפרעה בזרימת הלימפה עם נזק מינימלי לתאי הלימפה הלימפה בpLN המתנקז, כלי הלימפה אפרנטיים, כמו גם כלי לימפה אחרים באזור. שיטה זו שימשה כדי ללמוד כיצד משפיע הלימפה venules אנדותל גבוה (HEV) וביטוי chemokine ב LN, ואיך הלימפה זורמת דרך רקמת שומן המקיפה את LN בהיעדר כלי לימפה פונקציונליים. עם ההכרה הגוברת בחשיבות של תפקוד הלימפה, שיטה זו תהיה יישומים רחבים יותר כדי לפענח עוד יותר את הפונקציה של כלי לימפה בוויסות microenvironment LN ותגובות חיסוניות.
Introduction
הארגון המרחבי של מערכת הלימפה מספק תמיכה מבנית ופונקציונלית כדי להסיר ביעילות נוגדנים נוזלים חוץ תאיים והובלה ותאים אנטיגן הצגת (APCs) ל- LNs ניקוז. כלי הלימפה הראשוניים (הנקראים גם נימי לימפה) חדירים מאוד בשל הצמתים הבין-תאיים הבלתי רציפים שלהם, המקלים על האיסוף היעיל של נוזלים, תאים וחומרים אחרים מהחללים החוץ-תאייםשמסביב 1. כלי הלימפה הראשוניים מתמזגים לאיסוף כלי לימפה, בעלי צמתים בין-תאיים הדוקים, קרום מרתף רציף וכיסוי שריר הלימפה. איסוף כלי לימפה אחראים על הובלת לימפה שנאספו ל-LNs המתנקז ובסופו של דבר חזרה לימפה למחזור2,3. כלי הלימפה הנאספים שהניעו את הלימפה לתוך ה-LN המתנקז הם כלי הלימפההאדירים 4,5,6,7. חסימה של כלי לימפה אפילנטיים יכול לחסום את זרימת הלימפה לתוך LNs, שהיא טכניקה שימושית בעת לימוד הפונקציה של זרימת הלימפה.
מחקרים קודמים הראו כי זרימת הלימפה ממלאת תפקיד משמעותי בהעברת אנטיגן וAPCs, כמו גם שמירה על הומוסטאזיס LN. זה מובן היטב כי APCs נגזר רקמות, מופעל בדרך כלל נדידה תאים דנדריטיים (DCs), לנסוע דרך כלי לימפה אפרנטיים LN כדי להפעיל תאי T8. הרעיון כי אנטיגן בצורה חופשית, כגון חיידקים או אנטיגן מסיס, באופן פסיבי לזרום עם הלימפה ל LN כדי להפעיל APCs תושב LN כבר צובר קבלהבעשור האחרון 9,10,11,12. אנטיגן בצורה חופשית נסיעה עם לימפה לקחת דקות לאחר הזיהום לנסוע LN, ואת הפעלת התא תושב LN עלולה להתרחש בתוך 20 דקות לאחר הגירוי. זה הרבה יותר מהר מאשר ההפעלה של מחשבי מחשבים נודדים, אשר לוקח יותר מ 8 שעות כדי להיכנס LN9 ניקוז. מלבד הובלת אנטיגן ליזום הגנה חיסונית, הלימפה נושאת גם ציטוקינות ו-DCs ל LN כדי לשמור על המיקרו-סביבה שלה, ולתמוך בהומפואוסטזיס של תאימערכת החיסון 13,14. בעבר, חסימת זרימת הלימפה על ידי תפירת כלי הלימפה afferent הוכיח כי הלימפה נדרשת כדי לשמור על פנוטיפ HEV הנדרש לתמיכה בתא T הומאוסטטי ותא B ביות LN15,16,17. CCL21 הוא צ’מוקין קריטי הכוון את מיקום תאי DC ו- T ב- LN8,18. חסימת זרימת הלימפה מפריעה לביטוי CCL21 ב- LN ועלולה להפריע למיקום תאי DC ו-T ו/או אינטראקציה ב- LN19. לכן, חסימת זרימת הלימפה יכולה במישרין או בעקיפין לחסום את הגישה אנטיגן / DC ל LN ניקוז על ידי שיבוש microenvironment LN המסדיר את התגובות החיסוניות ב LN. כדי לחקור טוב יותר את הפונקציה של זרימת הלימפה, פרוטוקול ניסיוני מוצג(איור 1) כדילחסום את זרימת הלימפה בעכברים על ידי תפירת כלי הלימפה אפרנטיים ממשטח הרגל לpLN. שיטה זו יכולה להיות טכניקה חשובה עבור מחקרים עתידיים על תפקוד הלימפה בתנאים בריאים ומחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
חסימת זרימת הלימפה יהיו יישומים רחבים במניפולציה אספקת אנטיגן ל LN בתנאים בריאים ומחלות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לשלוט בתזמון של אספקת אנטיגן על מנת ללמוד כיצד זרימת הלימפה רציפה מווסתת את התגובה החיסונית בניקוז LNs. שיטה זו של הפרעת זרימת הלימפה יכול לשמש גם כדי ללמוד כיצד לימפה משפיעה על ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לאווה זרדינז’אד על הגהה של כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR, PJT-156035) וקרן קנדה לחדשנות עבור SL (32930), ועל ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין עבור יוג’יה לין (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
