تحديد وتوصيف أنواع الحمض المناعي للرنا في مسببات الحساسية HDM التي تعدل التهاب الرئة اليوزيوزي
Summary
غالبًا ما تحتوي المواد المسببة للحساسية البيئية مثل عث الغبار في المنزل (HDM) على مواد ميكروبية تنشط الاستجابات المناعية الفطرية لتنظيم التهاب الحساسية. البروتوكول المقدم هنا يوضح تحديد أنواع dsRNA في المواد المسببة للحساسية HDM وتوصيف أنشطتها المناعية في تعديل التهاب الرئة اليوزيني.
Abstract
مسببات الحساسية البيئية مثل عث الغبار المنزل (HDM) وغالبا ما تكون في أشكال معقدة تحتوي على كل من البروتينات الحساسية التي تدفع ردود من النوع 2 الشاذة والمواد الميكروبية التي تحفز الاستجابات المناعية الفطرية. تلعب هذه المكونات الميكروبية المرتبطة بالحساسية دورًا مهمًا في تنظيم تطور الحالات الالتهابية من النوع 2 مثل الربو التحسسي. غير أن الآليات الأساسية لا تزال غير محددة إلى حد كبير. البروتوكول المعروض هنا يحدد الخصائص الهيكلية ونشاط في الجسم الحي من الحمض النووي الريبي المسبب للحساسية المرتبطة بالمناعة. على وجه التحديد، يتم فحص المواد المسببة للحساسية المشتركة لوجود دنا مزدوجة التي تقطعت بها السبل (dsRNA) الأنواع التي يمكن أن تحفز ردود IFN في الرئتين وكبح جماح تطور يهون الرئة الحادة في نموذج الماوس من الربو التحسسي الناجم عن HDM. هنا، قمنا بتضمين ثلاثة فحوصات التالية: نقطة لطخة لإظهار هياكل DSRNA في مجموع الحمض النووي الريبي معزولة من مسببات الحساسية بما في ذلك أنواع HDM، RT-qPCR لقياس أنشطة HDM RNA في الجينات محفزة إنترفيرون (ISGs) التعبير في الرئتين الماوس وتحليل القوات المسلحة الكونغولية لتحديد آثار الحمض النووي HDM على عدد من الحمض النووي في BAL والرئة، على التوالي.
Introduction
استنادا إلى فرضية النظافة المقترحة أصلا من قبل ستراكان1, في مرحلة مبكرة من الطفولة التعرض للعوامل الميكروبية البيئية مثل الانستوكين يمكن أن تحمي ضد تطور الاضطرابات التحسسية2,3. أثناء الالتهابات الميكروبية، على سبيل المثال، العدوى الفيروسية، والكشف المناعي الفطري للأحماض النووية الأجنبية (RNA/DNA) يؤدي إلى استجابات الدفاع المضيف4،5،6. ومع ذلك ، فإن وجود وانتشار الأحماض النووية المناعية مثل أنواع الحمض النووي الريبي (DSRNA) الطويلة التي تقطعت بها السبل في عث الغبار المنزلية (HDM) أو مسببات الحساسية الأخرى للحشرات لا تزال غير معروفة. تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان HDM أو مسببات الحساسية الحشرية وغير الحشرية تحتوي على أنواع طويلة من dsRNA التي يمكن أن تنشط استجابة مناعية وقائية لمواجهة تطور التهاب الرئة اليوسينوفيلي الحاد في نموذج فأر للربو التحسسي. هنا، ونحن نقدم ثلاث طرق بسيطة وسريعة لتقييم المحددات الهيكلية في رنا هد إم مجموع التي هي مطلوبة لتنظيم التهاب الرئة النيوزنوفيلي الناجم عن مسببات الحساسية.
الجهاز المناعي المخاطي هو أكبر جهاز مناعي في الجسم ويعمل كخط أول للدفاع المضيف ضد كل من الالتهابات الميكروبية والشتائم التحسسية7,8. وdsRNA طويلة، ووسيط تكرار العديد من الفيروسات، ومن المعروف أن تعمل كنمط الجزيئية المرتبطة بعوامل الأمراض (PAMP) لتحفيز الاستجابات الفطرية بقوة عبر حصيلة مثل مستقبلات 3 (TLR3) للحث على التعبير عن الجينات محفزة إنترفيرون (ISGs)9،10،11،12،13،14. لقد أظهرنا مؤخرا أن RNA هد ام الكلي يحتوي على هياكل dsRNA، والتي upregulated التعبير عن ISGs والحد من التهاب الرئة يهونوسوسي شديد عندما تدار عن طريق تقطير داخلtracheal في نموذج مورين من الربو التحسسي الناجمة عن مقتطفات HDM15. يتم تحديد شدة التهابات الرئة عن طريق تحليل أنواع الخلايا المناعية في bronchoalveolar lavage (BAL) والأنسجة الرئوية عن طريق تدفق16،17،18،19،20.
ويتضمن هذا البروتوكول ثلاثة مقايسات: 1) الكشف السريع عن هياكل DSRNA مع لطخة نقطة RNA باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة الماوس J2 الذي يربط على وجه التحديد إلى dsRNA (≥40bp) بطريقة مستقلة عن تسلسل؛ 2) تقييم سريع لمؤثرات vivo من الحمض المناعي الريبي في الرئتين الماوس عن طريق قياس تحريض ISGs باستخدام RT-qPCR؛ 3) القياس الكمي الدقيق للويوزنوفيليات في BAL والرئة في سياق التهاب الرئة الناجم عن HDM باستخدام تحليل تدفق قياس الخلايا.
يمكن استخدام التشايسات أعلاه لدراسة ليس فقط أمراض الرئة التحسسية ، ولكن أيضًا الالتهابات البكتيرية والفيروسية التنفسية. على سبيل المثال، يمكن أيضا أن تستخدم الأجسام المضادة J2 DSRNA محددة في تطبيقات أخرى مثل الكروماتوغرافيا المناعية، وhistochemistry المناعية، والمناعة المرتبطة الانزيم المقايسة (ELISA) والمناعة21،22،23. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العديد من التطبيقات المصب من جمع السوائل BAL لتحديد كمي المحتويات القابلة للذوبان مثل السيتوكينات و chemokines باستخدام ELISA، والتنسخ التنميط للخلايا في الشعب الهوائية (على سبيل المثال، الضامة السنخية). على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من البروتوكولات المتاحة في المؤلفات لتقييم حالات الرئة، فإن معظم هذه البروتوكولات غالباً ما تركز على التحقق من الصحة المستهدفة. يمكن تطبيق الإجراءات الموضحة هنا لتحديد المكونات في المواد المسببة للحساسية البيئية المهمة لتنظيم تطور أمراض الحساسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول الحالي كيفية تقييم خصائص التحفيز المناعي للحمض النووي الميكروبي المرتبط بالحساسية وتأثيراتها على تطور التهاب الرئة اليوزيني في نموذج الماوس للربو التحسسي. على الرغم من أن dsRNAs طويلة معروفة وسيطة النسخ المتماثل من العديد من الفيروسات التي يمكن أن تنشط بقوة استجابات الإنتر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيدة كارلا غورينا على المساعدة التقنية في عملية استئصال الانسياب. يدعم L.S. مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة الابتكار في مقاطعة هونان للدراسات العليا (CX201713068). ويدعم سموه قسم علوم المختبرات السريرية، كلية العلوم الطبية التطبيقية، جامعة الجوف، ساكاكا، المملكة العربية السعودية. ويدعم X.D.L. من قبل UT الصحة سان انطونيو الصحة كلية الطب بدء تشغيل صندوق وماكس وميني فويلكر الصندوق.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
