Identifizierung und Charakterisierung immunogener RNA-Arten in HDM-Allergenen, die eosinophile Lungenentzündungen modulieren
Summary
Umweltallergene wie Hausstaubmilben (HDM) enthalten oft mikrobielle Substanzen, die angeborene Immunreaktionen aktivieren, um allergische Entzündungen zu regulieren. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt die Identifizierung von dsRNA-Arten in HDM-Allergenen und die Charakterisierung ihrer immunogenen Aktivitäten bei der Modulation eosinophiler Lungenentzündungen.
Abstract
Umweltallergene wie Hausstaubmilben (HDM) sind oft in komplexen Formen, die sowohl allergische Proteine enthalten, die aberrante Typ-2-Antworten antreiben, als auch mikrobielle Substanzen, die angeborene Immunreaktionen auslösen. Diese allergenassoziierten mikrobiellen Komponenten spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Entwicklung von Typ-2-Entzündlichen Erkrankungen wie allergischem Asthma. Die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben jedoch weitgehend undefiniert. Das hier vorgestellte Protokoll bestimmt die strukturellen Eigenschaften und die In-vivo-Aktivität allergenassoziierter immunostimulatorischer RNA. Insbesondere werden häufige Allergene auf das Vorhandensein von doppelsträngigen RNA-Arten (dsRNA) untersucht, die IFN-Reaktionen in der Lunge stimulieren und die Entwicklung schwerer Lungeneosinophilie in einem Mausmodell von HDM-induziertem allergischem Asthma hemmen können. Hier haben wir die folgenden drei Assays aufgenommen: Dot blot, um die dsRNA-Strukturen in der gesamten RNA zu zeigen, die von Allergenen einschließlich HDM-Arten isoliert sind, RT-qPCR zur Messung der Aktivitäten von HDM-RNA in interferonstimulierender Gene (ISGs) Expression in der Mauslunge und FACS-Analyse zur Bestimmung der Auswirkungen von HDM-RNA auf die Anzahl der Eosinophile in BAL bzw. Lunge.
Introduction
Basierend auf der ursprünglich von Strachan1vorgeschlagenen Hygienehypothese kann die frühkindliche Exposition gegenüber mikrobiellen Umweltfaktoren wie Endotoxin vor der Entwicklung allergischer Erkrankungen schützen2,3. Bei mikrobiellen Infektionen, z.B. Virusinfektionen, löst der angeborene Immundetektion von Fremdnukleinsäuren (RNA/DNA) Wirtsabwehrreaktionen4,5,6aus. Die Existenz und Prävalenz immunogener Nukleinsäuren wie lange doppelsträngige RNA-Arten (dsRNA) in Hausstaubmilben (HDM) oder anderen Insektenallergenen bleibt jedoch unbekannt. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um festzustellen, ob HDM oder Insekten- und Nicht-Insektenallergene lange dsRNA-Arten enthalten, die eine schützende Immunantwort aktivieren können, um der Entwicklung einer schweren eosinophilen Lungenentzündung in einem Mausmodell von allergischem Asthma entgegenzuwirken. Hier bieten wir drei einfache und schnelle Methoden zur Bewertung der strukturellen Determinanten in HDM-Gesamt-RNA, die zur Regulierung allergeninduzierter eosinophiler Lungenentzündungen erforderlich sind.
Das Mukosal-Immunsystem ist das größte Immunorgan im Körper und dient als erste Linie der Wirtsabwehr gegen mikrobielle Infektionen und allergische Beleidigungen7,8. Die lange dsRNA, das Replikationszwischenprodukt vieler Viren, ist dafür bekannt, als pathogenassoziiertes molekulares Muster (PAMP) zu fungieren, um angeborene Reaktionen über Toll wie Rezeptor 3 (TLR3) wirksam zu stimulieren, um die Expression von Interferon-stimulierten Genen (ISGs)9,10,11,12,13,14zu induzieren. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass HDM-Gesamt-RNA dsRNA-Strukturen enthielt, die die Expression von ISGs hochregulierten und eine schwere eosinophile Lungenentzündung reduzierten, wenn sie über die intratracheale Instillation in einem murinen Modell von allergischem Asthma verabreicht wurde, das durch HDM-Extrakte induziert wurde15. Die Schwere der Lungenentzündungen wird durch die Analyse der Immunzelltypen in bronchoalveolarer Spülung (BAL) und Lungengewebe mittels Durchflusszytometrie16,17,18,19,20bestimmt.
Dieses Protokoll enthält drei Assays: 1) schnelles Detektion von dsRNA-Strukturen mit RNA-Punktfleck mit einem mausmonoklonalen Antikörper J2, der speziell sequenzunabhängig an die dsRNA bindet; 2) schnelle Auswertung der In-vivo-Effekte immunostimulierender RNA in der Mauslunge durch Messung der Induktion von ISGs mit RT-qPCR; 3) genaue Quantifizierung von Eosinophilen in BAL und Lunge im Kontext von HDM-induzierten Lungenentzündungen mittels Flow-Zytometrie-Analyse.
Die oben genannten Assays können verwendet werden, um nicht nur allergische Lungenerkrankungen zu untersuchen, sondern auch respiratorische bakterielle und virale Infektionen. Beispielsweise kann der dsRNA-spezifische J2-Antikörper auch in anderen Anwendungen wie Immunaffinitätschromatographie, Immunhistochemie, enzymgebundenem Immunsorbent-Assay (ELISA) und Immunostaining21,22,23eingesetzt werden. Darüber hinaus können mehrere Anwendungen nach der BAL-Flüssigkeitssammlung zur Quantifizierung löslicher Inhalte wie Zytokine und Chemokine mit ELISA und Transkriptionsprofilierung von Zellen in den Atemwegen (z. B. Alveolarmakrophagen) genutzt werden. Obwohl es eine Vielzahl von Protokollen in der Literatur zur Bewertung von Lungenerkrankungen gibt, konzentrieren sich die meisten dieser Protokolle häufig auf die Zielvalidierung. Die hier beschriebenen Verfahren können angewendet werden, um Komponenten in Umweltallergenen zu identifizieren, die für die Regulierung der Entwicklung allergischer Krankheiten wichtig sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt, wie die immunstimulierenden Eigenschaften allergenassoziierter mikrobieller RNA und ihre Auswirkungen auf die Entwicklung von eosinophiler Lungenentzündung in einem Mausmodell von allergischem Asthma bewertet werden können. Obwohl lange dsRNAs als Replikationszwischenprodukte vieler Viren bekannt sind, die Interferon-Reaktionen in Säugetierzellen wirksam aktivieren können, waren ihre Präsenz in HDM-Allergenen bis zu unserer jüngsten Arbeitunbekannt 15. Die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Karla Gorena für die technische Unterstützung in der Durchflusszytometrie. L.S. wird vom China Scholarship Council und der Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068) unterstützt. H.H.A. wird vom Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudi-Arabien unterstützt. X.D.L. wird vom UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund und dem Max and Minnei Voelcker Fund unterstützt.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
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