पर्यावरणीय एलर्जी जैसे घर की धूल के कण (एचडीएम) में अक्सर माइक्रोबियल पदार्थ होते हैं जो एलर्जी सूजन को विनियमित करने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एचडीएम एलर्जी में डीएसआरएनए प्रजातियों की पहचान और इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन में उनकी इम्यूनोजेनिक गतिविधियों के लक्षण वर्णन को दर्शाता है।
पर्यावरणीय एलर्जी जैसे घर की धूल के कण (एचडीएम) अक्सर जटिल रूपों में होते हैं जिनमें एलर्जी प्रोटीन दोनों होते हैं जो गुमराह प्रकार 2 प्रतिक्रियाओं और माइक्रोबियल पदार्थों को ड्राइव करते हैं जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं। ये एलर्जी से जुड़े माइक्रोबियल घटक एलर्जी अस्थमा जैसी टाइप 2 भड़काऊ स्थितियों के विकास को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अपरिभाषित रहते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल संरचनात्मक विशेषताओं और एलर्जेन से जुड़े इम्यूनोस्टिमुलेटरी आरएनए की वीवो गतिविधि में निर्धारित करता है। विशेष रूप से, सामान्य एलर्जी की जांच डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) प्रजातियों की उपस्थिति के लिए की जाती है जो फेफड़ों में आईएफएन प्रतिक्रियाओं को प्रोत्साहित कर सकती हैं और एचडीएम-प्रेरित एलर्जी अस्थमा के माउस मॉडल में गंभीर फेफड़ों के इओसिनोफिलिया के विकास को नियंत्रित कर सकती हैं। यहां, हमने निम्नलिखित तीन परखों को शामिल किया है: डी डॉट दाग कुल आरएनए में डीएसआरएनए संरचनाओं को दिखाने के लिए एचडीएम प्रजातियों सहित एलर्जी से अलग, आर टी-क्यूपीसीआर में एचडीएम आरएनए की गतिविधियों को मापने के लिए माउस फेफड़ों और FACS विश्लेषण में इंटरफेरॉन उत्तेजक जीन (आईएसजी) अभिव्यक्ति में क्रमशः बाल और फेफड़ों में eosinophils की संख्या पर HDM आरएनए के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए ।
मूल रूप से स्ट्रैचन1द्वारा प्रस्तावित स्वच्छता परिकल्पना के आधार पर , एंडोटॉक्सिन जैसे पर्यावरणीय माइक्रोबियल कारकों के लिए बचपन का संपर्क एलर्जी विकारों के विकास से रक्षा कर सकता है2,3. माइक्रोबियल संक्रमण के दौरान, उदाहरण के लिए, वायरल संक्रमण, विदेशी न्यूक्लिक एसिड (आरएनए/डीएनए) का जन्मजात प्रतिरक्षा पहचान मेजबान रक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करता है4,,5,,6। हालांकि, घर के धूल के कण (एचडीएम) या अन्य कीट एलर्जी में लंबे समय तक फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) प्रजातियों जैसे इम्यूनोजेनिक न्यूक्लिक एसिड का अस्तित्व और प्रसार अज्ञात रहता है। यह प्रोटोकॉल यह निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था कि क्या एचडीएम या कीट और गैर-कीट एलर्जी में लंबी डीएसआरएनए प्रजातियां हैं जो एलर्जी अस्थमा के माउस मॉडल में गंभीर इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन के विकास का प्रतिकार करने के लिए एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय कर सकती हैं। यहां, हम एचडीएम टोटल आरएनए में संरचनात्मक निर्धारकों का मूल्यांकन करने के लिए तीन सरल और तेज तरीके प्रदान करते हैं जो एलर्जी-प्रेरित इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन को विनियमित करने के लिए आवश्यक हैं।
म्यूकोसल इम्यून सिस्टम शरीर का सबसे बडा इम्यून ऑर्गन है और माइक्रोबियल इन्फेक्शन और एलर्जिक दोनों के अपमान के खिलाफ मेजबान रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करता है7,8. कई वायरसों के मध्यवर्ती लंबे dsRNA, एक रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न (PAMP) के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है ताकि इंटरफेरॉन उत्तेजित जीन (आईएसजी)9,,11,1210, 11, 12,,13,14की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए रिसेप्टर 3 (टीएलआर3) जैसे टोल के माध्यम से जन्मजात प्रतिक्रियाओं को शक्तिशाली रूप से उत्तेजित किया जा सके।,, हमने हाल ही में दिखाया है कि एचडीएम टोटल आरएनए में डीएसआरएनए संरचनाएं थीं, जिन्होंने आईएसजी की अभिव्यक्ति को बढ़ाया और एचडीएम अर्क15द्वारा प्रेरित एलर्जी अस्थमा के मुरीन मॉडल में इंट्राचेल इंसिलेशन के माध्यम से प्रशासित होने पर गंभीर इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन को कम किया। फेफड़ों की सूजन की गंभीरता का निर्धारण ब्रोंकोलवेओलर लावेज (बाल) और फेफड़ों के ऊतकों में प्रवाह साइटोमेट्री16 , 17 , 18,,19,20,के माध्यम से प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों का विश्लेषण करके कियाजाताहै ।20
इस प्रोटोकॉल में तीन परख शामिल हैं: 1) माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जे 2 का उपयोग करके आरएनए डॉट दाग के साथ डीएसआरएनए संरचनाओं का तेजी से पता लगाना जो विशेष रूप से एक अनुक्रम-स्वतंत्र तरीके से डीएसआरएनए (40bp) से बांधता है; 2) आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके आईएसजी के प्रेरण को मापकर माउस फेफड़ों में इम्यूनोस्टिमुलेटरी आरएनए के वीवो प्रभावों के लिए त्वरित मूल्यांकन; 3) प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके एचडीएम-प्रेरित फेफड़ों की सूजन के संदर्भ में बाल और फेफड़ों में इओसिनोफिल का सटीक मात्राकरण।
उपरोक्त परख का उपयोग न केवल एलर्जी फेफड़ों की बीमारियों, बल्कि श्वसन जीवाणु और वायरल संक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डीएसआरएनए विशिष्ट जे 2 एंटीबॉडी का उपयोग अन्य अनुप्रयोगों जैसे इम्यूनोएफिनिटी क्रोमेटोग्राफी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरेब्रेंट परख (एलिसा) और इम्यूनोस्टेपिंग21,22,,23में भी किया जा सकता है।, इसके अलावा, बाल द्रव संग्रह के डाउनस्ट्रीम कई अनुप्रयोगों का उपयोग एलिसा का उपयोग करके साइटोकिन्स और केमोकिंस जैसी घुलनशील सामग्री की मात्रा निर्धारित करने और वायुमार्ग (उदाहरण के लिए, अल्वेलर मैक्रोफेज) में कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग के लिए किया जा सकता है। यद्यपि फेफड़ों की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए साहित्य में विभिन्न प्रकार के प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल अक्सर लक्ष्य सत्यापन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। यहां वर्णित प्रक्रियाओं को पर्यावरण एलर्जी में घटकों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है जो एलर्जी रोगों के विकास को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल में एलर्जी से जुड़े माइक्रोबियल आरएनए के इम्यूनोस्टिमुलेटरी गुणों और एलर्जी अस्थमा के माउस मॉडल में इओसिनोफिलिक फेफड़ों की सूजन के विकास पर उनके प्रभावों का मूल्यांकन कैसे किया ज…
The authors have nothing to disclose.
हम सुश्री कार्ला गोरेना को प्रवाह साइटोमेट्री में तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं । एलएस को चाइना स्कॉलरशिप काउंसिल और हुआन प्रांतीय इनोवेशन फाउंडेशन फॉर पोस्टग्रेजुएट (CX201713068) द्वारा समर्थित किया गया है । H.H.A. नैदानिक प्रयोगशाला विज्ञान विभाग, एप्लाइड मेडिकल साइंसेज के कॉलेज, Jouf विश्वविद्यालय, साका, सऊदी अरब द्वारा समर्थित है । एक्स.डी.एल. यूटी हेल्थ सैन एंटोनियो स्कूल ऑफ मेडिसिन स्टार्टअप फंड और मैक्स एंड मिनेई वोल्कर फंड द्वारा समर्थित है।
0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
Fly | Greer Laboratories | B8 | |
Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
HT-DNA | Sigma | D6898 | |
In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
Microscope | Olympus | CK30 | |
Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
Nylon string | Dynarex | 3243 | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
TBS | (see recipe in Table 5) | ||
TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |