好酸球性肺炎症を調節するHDMアレルゲンにおける免疫原性RNA種の同定と特性評価
Summary
ハウスダニ(HDM)などの環境アレルゲンには、アレルギー性炎症を調節するために自然免疫応答を活性化する微生物物質が含まれていることが多い。ここで示したプロトコルは、好酸球性肺の炎症を調節する際のHDMアレルゲンにおけるdsRNA種の同定と免疫原性活性の特徴を示す。
Abstract
ハウスダニ(HDM)などの環境アレルゲンは、異常な2型応答を駆動するアレルギータンパク質と自然免疫応答を誘導する微生物物質の両方を含む複雑な形態であることが多い。これらのアレルゲン関連微生物成分は、アレルギー性喘息などの2型炎症性疾患の発症を調節する上で重要な役割を果たす。ただし、基礎となるメカニズムはほとんど定義されていません。ここで提示されるプロトコルは、アレルゲン関連免疫刺激RNAの構造的特性およびインビボ活性を決定する。具体的には、肺におけるIFN応答を刺激し、HDM誘発性アレルギー性喘息のマウスモデルにおける重度の肺好酸球症の発症を抑制することができる二本鎖RNA(dsRNA)種の存在について調べられる。ここでは、HDM種を含むアレルゲンから単離された全RNA中のdsRNA構造を示すドットブロット、マウス肺におけるインターフェロン刺激遺伝子(ISG)発現におけるHDM RNAの活動を測定するRT-qPCR、およびBALおよび肺における好酸球数に対するHDM RNAの影響を決定するFACS分析の3つのアッセイを含む。
Introduction
ストラチャン1が当初提案した衛生仮説に基づいて、内毒素などの環境微生物因子への幼児期の暴露は、アレルギー障害の発症から22、33を防ぐ。微生物感染の間、例えば、ウイルス感染、外来核酸の自然免疫検出(RNA/DNA)は宿主防御応答44、5、65,6を引き起こす。しかし、ハウスダニ(HDM)や他の昆虫アレルゲン中の長い二本鎖RNA(dsRNA)種などの免疫原性核酸の存在と有病率は不明のままである。このプロトコルは、HDMまたは昆虫および非昆虫アレルゲンが、アレルギー性喘息のマウスモデルにおける重度の好酸球性肺炎症の発症を打ち消すために保護免疫応答を活性化することができる長いdsRNA種を含むかどうかを決定するために設計された。ここでは、アレルゲン誘導性好酸球性肺の炎症を調節するために必要なHDM全RNAの構造決定因子を評価するための3つの簡単かつ迅速な方法を提供する。
粘膜免疫系は、体内で最大の免疫器官であり、微生物感染とアレルギー侮辱77,88の両方に対する宿主防御の第一線として機能する。長いdsRNAとは、多くのウイルスの複製中間体であり、病原体関連分子パターン(PAMP)として機能し、インターフェロン刺激遺伝子(ISGs)9、10、11、12、13、14の発現を誘導する9,10,11,12,13,14トール様受容体3(TLR3)を介して生来応答を強力に刺激することが知られている。我々は最近、HDM全RNAにdsRNA構造が含まれていることを示し、HDM抽出物15によって誘発されるアレルギー性喘息のマウスモデルにおいて、ISGの発現をアップレギュレートし、重度の好酸球性肺炎症を減少させた。肺の炎症の重症度は、フローサイトメ,トリー16、17、18、19、20を介して気管支肺胞洗浄16,17,18(BAL)および肺組織における免疫細胞タイプ19を20分析することによって決定される。
このプロトコルには、3つのアッセイが含まれています:1)特異的に配列に依存しない方法でdsRNA(≥40bp)に結合するマウスモノクローナル抗体J2を使用してRNAドットブロットを用いるdsRNA構造の迅速な検出;2) マウス肺における免疫刺激RNAのインビボ効果の迅速な評価は、RT-qPCRを用いてISGの誘導を測定する;3) フローサイトメトリー解析を用いたHDM誘発肺炎症の文脈におけるBALおよび肺における好酸球の正確な定量化。
上記のアッセイは、アレルギー性肺疾患だけでなく、呼吸器細菌およびウイルス感染の研究にも使用することができる。例えば、dsRNA特異的J2抗体は、免疫親和性クロマトグラフィー、免疫体化学、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)および免疫染色21、22、2322,などの他の21用途にも使用することができる。23加えて、BAL流体採取の下流にあるいくつかの用途は、ELISAを用いてサイトカインおよびケモカインなどの可溶性内容物を定量化するために利用することができ、また、気道における細胞の転写プロファイリング(例えば、肺胞マクロファージ)である。文献には肺の状態を評価するために利用できるさまざまなプロトコルがありますが、これらのプロトコルのほとんどはしばしばターゲット検証に焦点を当てています。ここで説明する手順は、アレルギー疾患の発症を調節するために重要な環境アレルゲン中の成分を同定するために適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルは、アレルギー性喘息のマウスモデルにおける好酸球性肺炎症の発症に対するアレルゲン関連微生物RNAの免疫刺激特性およびそれらの影響を評価する方法を記述する。長いdsRNAは哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答を強力に活性化することができる多くのウイルスの複製中間体として知られているが、HDMアレルゲンにおけるそれらの存在は我々の最近の研究<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フローサイトメトリーの技術支援をしてくれたカーラ・ゴレナさんに感謝します。L.S.は、中国奨学金協議会と湖南省大学院イノベーション財団(CX201713068)の支援を受けています。H.H.A.は、サウジアラビアのサカカ大学ジュフ大学応用医科学部臨床検査科学科の支援を受けています。X.D.L.は、UTヘルスサンアントニオ医学スタートアップファンドとマックスとミニーボーカー基金によってサポートされています。
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
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