호산성 폐 염증을 조절하는 HDM 알레르겐의 면역원성 RNA 종의 식별 및 특성화
Summary
집 먼지 진드기 (HDM)와 같은 환경 알레르겐은 종종 알레르기 염증을 조절하기 위해 선천적 인 면역 반응을 활성화하는 미생물 물질을 함유하고 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 HDM 알레르겐에서 dsRNA 종의 식별과 호산성 폐 염증을 조절하는 면역원성 활동의 특성화를 보여줍니다.
Abstract
집 먼지 진드기 (HDM)와 같은 환경 알레르겐은 종종 비정상적인 유형 2 반응을 구동하는 알레르기 성 단백질과 타고난 면역 반응을 유도하는 미생물 물질을 포함하는 복잡한 형태로 종종 있습니다. 이러한 알레르겐 관련 미생물 성분은 알레르기 성 천식과 같은 타입-2 염증 조건의 발달을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나 기본 메커니즘은 크게 정의되지 않은 상태로 유지됩니다. 여기서 제시된 프로토콜은 알레르겐 관련 면역 자극RNA의 구조적 특성 및 생체 내 활성을 결정한다. 구체적으로, 일반적인 알레르겐은 폐에서 IFN 반응을 자극하고 HDM 유도 알레르기 천식의 마우스 모델에서 중증 폐 호산구의 발달을 억제할 수 있는 이중 좌초 RNA(dsRNA) 종의 존재를 검사한다. 여기서, 우리는 다음과 같은 세 가지 분석을 포함했다: HDM 종을 포함한 알레르겐으로부터 분리된 총 RNA에서 dsRNA 구조를 보여주는 도트 블롯, RT-qPCR은 마우스 폐및 FACS 분석에서 인터페론 자극 유전자(ISGs) 발현에서 HDM RNA의 활동을 측정하여 각각 BAL및 폐, 폐의 EOSinophils수에 대한 HDM RNA의 효과를 결정한다.
Introduction
스트라찬1이원래 제안한 위생 가설에 기초하여, 내독소와 같은 환경 미생물 인자에 대한 유아 노출은 알레르기 장애2,,3의발달로부터 보호 할 수 있습니다. 미생물 감염 중, 예를 들어, 바이러스 감염, 외국 핵산(RNA/DNA)의 선천적인 면역 검출은 호스트 방어 반응을4,,5,,6을유발한다. 그러나, 집먼지 진드기(HDM) 또는 다른 곤충 알레르겐에서 긴 이중 좌초 RNA(dsRNA) 종과 같은 면역원성 핵산의 존재 그리고 유병률은 알려지지 않은 채로 남아 있다. 이 프로토콜은 HDM 또는 곤충 및 비 곤충 알레르겐이 알레르기 성 천식의 마우스 모델에서 심각한 호산성 폐 염증의 발달을 중화하기 위해 보호 면역 반응을 활성화 할 수있는 긴 dsRNA 종을 포함 여부를 결정하기 위해 설계되었습니다. 여기서, 우리는 알레르겐 유도 호산성 폐 염증을 조절하는 데 필요한 HDM 총 RNA에서 구조적 결정요인을 평가하는 세 가지 간단하고 빠른 방법을 제공한다.
점막 면역 계통은 바디에서 가장 큰 면역 기관이고 미생물 감염 및 알레르기성 모욕 둘 다에 대하여 호스트 방어의 첫번째 선 역할을7,,8. 긴 dsRNA는, 많은 바이러스의 복제 중간체로서, 인터페론 자극 유전자(ISGs)9,,10,,,11,12,,13,14의발현을 유도하기 위해 수용체 3(TLR3)와 같은 톨을 통해 선천적 반응을 강력하게 자극하는 병원균 관련 분자 패턴(PAMP)으로 기능하는 것으로 알려져있다. 최근에는 HDM 총 RNA가 DSRNA 구조를 함유하고 있으며, 이는 ISGs의 발현을 조절하고 HDM 추출물에 의해 유도된 알레르기 성 천식의 뮤린 모델에서 내내 주입을 통해 투여될 때 심한 호산성 폐 염증을감소시켰다. 폐 염증의 중증도는 혈류,세포측정제16,,17,18,19,,20을통해 기관지알래 라베이지(BAL) 및 폐 조직에서 면역 세포 유형을 분석하여 결정된다.,
이 프로토콜은 3개의 분석서를 포함합니다: 1) 특이하게 dsRNA (≥40bp)에 서열 독립적인 방식으로 결합하는 마우스 단클론 항체 J2를 사용하여 RNA 도트 블롯을 가진 dsRNA 구조물의 신속한 검출; 2) RT-qPCR을 사용하여 ISGs의 유도를 측정하여 마우스 폐에서 면역 자극 RNA의 생체 내 효과에 대한 빠른 평가; 3) 혈류 세포측정 분석을 이용하여 HDM 유도 폐 염증의 맥락에서 BAL 및 폐에서 호산구의 정확한 정량화.
위의 에세이는 알레르기 성 폐 질환뿐만 아니라 호흡기 세균 및 바이러스 감염을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, dsRNA 특이적 J2 항체는 면역화성 크로마토그래피, 면역히스토케, 효소-연결된 면역소벤트 분석법(ELISA) 및 면역염색21,,22,,23과같은 다른 응용 분야에서도 사용될 수 있다. 또한, BAL 유체 수집의 하류에 여러 응용 분야는 ELISA를 사용하여 사이토카인 및 케모킨과 같은 용용성 함량을 정량화하고, 기도내 세포의 전사 프로파일링(예를 들어, 폐포 대식세포)에 활용될 수 있다. 폐 상태를 평가하기 위해 문헌에서 사용할 수있는 다양한 프로토콜이 있지만, 이러한 프로토콜의 대부분은 종종 대상 유효성 검사에 초점을 맞춥니다. 여기에 설명된 절차는 알레르기 성 질병의 발달을 조절하는 데 중요한 환경 알레르겐의 구성 요소를 식별하기 위해 적용 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜은 알레르기 성 천식의 마우스 모형에 있는 호산성 폐 염증의 발달에 알레르기성 관련 미생물 RNA의 면역 자극성 속성 및 그들의 충격을 평가하는 방법을 설명합니다. 긴 dsRNAs는 포유류 세포에 있는 인터페론 반응을 강력하게 활성화할 수 있는 많은 바이러스의 복제 중간체로 알려져 있더라도, HDM 알레르겐에 있는 그들의 존재는 우리의 최근 일15까지알려지지 않았?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
카를라 고레나(Karla Gorena) 씨는 유동 세포측정에 대한 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. L.S.는 중국 장학위원회와 후난지방혁신재단(CX201713068)의 지원을 받고 있습니다. H.H.A.는 사우디아라비아 주 사카카 주 응용 의학 대학 임상 실험실 과학과의 지원을 받고 있습니다. X.D.L.은 UT 헬스 샌안토니오 의과 대학 스타트업 펀드와 맥스 및 미니시 보엘커 기금의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
