Identifiering och karakterisering av immunogenic RNA Arter i HDM Allergener som modulerar Eosinofil lunginflammation
Summary
Miljöallergener som dammkvalster (HDM) innehåller ofta mikrobiella ämnen som aktiverar medfödda immunsvar för att reglera allergisk inflammation. Protokollet presenteras här visar identifiering av DSRNA arter i HDM allergener och karakterisering av deras immunogenic verksamhet i modulering eosinofila lungcancer inflammation.
Abstract
Miljöallergener som dammkvalster (HDM) är ofta i komplexa former som innehåller både allergiska proteiner som driver avvikande typ 2-svar och mikrobiella ämnen som inducerar medfödda immunsvar. Dessa allergen-associerade mikrobiella komponenter spelar en viktig roll i regleringen av utvecklingen av typ 2 inflammatoriska tillstånd såsom allergisk astma. De underliggande mekanismerna är dock fortfarande i stort sett odefinierade. Protokollet presenteras här bestämmer strukturella egenskaper och in vivo verksamhet allergen-associerade immunstimulerande RNA. Specifikt undersöks vanliga allergener för förekomsten av dubbelsträngade RNA (dsRNA) arter som kan stimulera IFN svar i lungorna och begränsa utvecklingen av svår lungeosinofili i en mus modell av HDM-inducerad allergisk astma. Här har vi inkluderat följande tre analyser: Dot blot att visa dsRNA strukturer i totalt RNA isolerade från allergener inklusive HDM arter, RT-qPCR att mäta verksamheten i HDM RNA i interferon stimulerande gener (ISGs) uttryck i mus lungor och FACS analys för att bestämma effekterna av HDM RNA på antalet eosinofiler i BAL och lunga, respektive.
Introduction
Baserat på hygienhypotesen som ursprungligen föreslogs av Strachan1, tidig barndom exponering för miljömässiga mikrobiella faktorer såsom endotoxin kan skydda mot utvecklingen av allergiska sjukdomar2,3. Vid mikrobiella infektioner, t.ex.4,5,6 Förekomsten och prevalensen av immunogena nukleinsyror såsom långa dubbelsträngade RNA-arter (dsRNA) i husdammmider (HDM) eller andra insektsallergener är dock fortfarande okända. Detta protokoll har utformats för att avgöra om HDM eller insekts- och non-insect allergener innehåller långa dsRNA-arter som kan aktivera ett skyddande immunsvar för att motverka utvecklingen av svår eosinofil lunginflammation i en musmodell av allergisk astma. Här erbjuder vi tre enkla och snabba metoder för att utvärdera de strukturella bestämningsfaktorerna i HDM totala RNA som krävs för att reglera allergen-inducerad eosinofil lunginflammation.
Den slemhinnan immunsystemet är den största immunsystemet i kroppen och fungerar som den första raden av värd försvar mot både mikrobiella infektioner och allergiska förolämpningar7,8. Den långa dsRNA, replikationen mellanliggande av många virus, är känd för att fungera som en patogen-associerade molekylära mönster (PAMP) för att kraftfullt stimulera medfödda svar via Toll som receptor 3 (TLR3) för att framkalla uttrycket av interferon stimuleras gener (ISGs)9,10,11,12,13,14. Vi har nyligen visat att HDM totala RNA innehöll dsRNA strukturer, som uppreglerade uttrycket av ISGs och minskade allvarliga eosinofila lunginflammation när de administreras via intratracheal instillation i en murine modell av allergisk astma framkallas av HDMextrakt 15. Svårighetsgraden av lunginflammationer bestäms genom att analysera immuncelltyperna i bronchoalveolar lavage (BAL) och lungvävnad via flödescytometri16,17,18,19,20.
Detta protokoll innehåller tre analyser: 1) snabb detektering av dsRNA-strukturer med RNA-punkt blot med hjälp av en mus monoklonal antikropp J2 som specifikt binder till dsRNA (≥40bp) på ett sekvensoberoende sätt; 2) snabb utvärdering för in vivo effekter av immunstimulerande RNA i mus lungor genom att mäta induktion av ISGs med HJÄLP AV RT-qPCR; 3) korrekt kvantifiering av eosinofiler i BAL och lunga i samband med HDM-inducerad lunginflammation med flöde cytometri analys.
Ovanstående analyser kan användas för att studera inte bara allergiska lungsjukdomar, men också respiratoriska bakteriella och virala infektioner. Till exempel kan dsRNA-specifika J2-antikroppar också användas i andra tillämpningar såsom immunoaffinitetkromatografi, immunohistokemi, enzymrelaterad immunsorbentanalys (ELISA) och immunbehållande21,22,23. Dessutom kan flera tillämpningar nedströms BAL-vätskeinsamling användas för att kvantifiera lösligt innehåll såsom cytokiner och chemokines med HJÄLP AV ELISA, och transkriptionell profilering av celler i luftvägarna (t.ex. alveolar makrofager). Även om det finns en mängd olika protokoll som finns i litteraturen för att utvärdera lungsjukdomar, fokuserar de flesta av dessa protokoll ofta på målvalideringen. De förfaranden som beskrivs här kan tillämpas för att identifiera komponenter i miljöallergener som är viktiga för att reglera utvecklingen av allergiska sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuvarande protokollet beskriver hur man utvärderar immunstimulerande egenskaper allergen-associerade mikrobiella RNA och deras effekter på utvecklingen av eosinofil lungcancer inflammation i en mus modell av allergisk astma. Även om långa dsRNAs är kända som replikering intermediärer av många virus som kan aktivera interferon svar i däggdjursceller, deras närvaro i HDM allergener har varit okänd tills vårt senaste arbete15. Kombinationen av RNA dot blot, RT-qPCR och FACS analys pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ms Karla Gorena för tekniskt stöd i flöde cytometri. L.S. stöds av China Scholarship Council och Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. stöds av Institutionen för kliniska laboratorievetenskaper, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudiarabien. X.D.L. stöds av UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund och Max och Minnei Voelcker Fund.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
