Eozinofilik Akciğer İltihabını Modüle Eden HDM Alerjenlerinde İmmünojenik RNA Türlerinin Tanımlanması ve Karakterizasyonu
Summary
Ev tozu akarları (HDM) gibi çevresel alerjenler genellikle alerjik iltihabı düzenlemek için doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını aktive mikrobiyal maddeler içerir. Burada sunulan protokol HDM alerjenlerinde dsRNA türlerinin tanımlanmasını ve eozinofilik akciğer iltihabının modüle edilmesinde immünojenik faaliyetlerinin karakterizasyonunu göstermektedir.
Abstract
Ev tozu akarları (HDM) gibi çevresel alerjenler genellikle anormal tip 2 yanıtları sürücü alerjik proteinler ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtları neden mikrobiyal maddeler hem içeren karmaşık formlarda bulunmaktadır. Bu alerjen ilişkili mikrobiyal bileşenler, alerjik astım gibi tip 2 inflamatuar koşulların gelişimini düzenleyen önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, altta yatan mekanizmalar büyük ölçüde tanımsız kalır. Burada sunulan protokol, alerjenilişkili immünsülatör RNA’nın yapısal özelliklerini ve in vivo aktivitesini belirler. Özellikle, ortak alerjenler akciğerlerde IFN yanıtlarını uyarabilir ve HDM kaynaklı alerjik astım bir fare modelinde şiddetli akciğer eozinofili gelişimini dizginlemek çift iplikli RNA (dsRNA) türlerinin varlığı için incelenir. Burada, aşağıdaki üç tahlilleri dahil ettik: HDM türleri de dahil olmak üzere alerjenlerden izole toplam RNA dsRNA yapıları göstermek için nokta leke, RT-qPCR interferon uyarıcı genlerde HDM RNA faaliyetlerini ölçmek için (ISGs) fare akciğerlerve FACS analizinde HDM RNA etkilerini belirlemek için BAL ve akciğer, sırasıyla.
Introduction
Hijyen hipotezi başlangıçta Strachantarafındanönerilen 1 , endotoksin gibi çevresel mikrobiyal faktörlere erken çocukluk maruz kalma alerjik bozuklukların gelişimine karşı koruyabilirsiniz2,3. Mikrobiyal enfeksiyonlar sırasında, örneğin, viral enfeksiyonlar, yabancı nükleik asitlerin doğuştan gelen bağışıklık tespiti (RNA / DNA) konak savunma yanıtlarıtetikler 4,5,6. Ancak, ev tozu akarları (HDM) veya diğer böcek alerjenlerinde uzun çift iplikli RNA (dsRNA) türleri gibi immünojenik nükleik asitlerin varlığı ve yaygınlığı bilinmemektedir. Bu protokol, HDM veya böcek ve böcek dışı alerjenlerin bir fare modelinde şiddetli eozinofilik akciğer iltihabı gelişimini etkisiz hale getirmek için koruyucu bir bağışıklık yanıtını aktive edebilen uzun dsRNA türleri içerip içermediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Burada, alerjen kaynaklı eozinofilik akciğer iltihabını düzenlemek için gerekli olan HDM toplam RNA yapısal belirleyicileri değerlendirmek için üç basit ve hızlı yöntem sağlar.
Mukozal bağışıklık sistemi vücuttaki en büyük bağışıklık organıdır ve hem mikrobiyal enfeksiyonlara hem de alerjik hakaretlere karşı ev sahibi savunmanın ilk satırı olarak hizmet vermektedir7,8. Uzun dsRNA, birçok virüsün replikasyon ara, bir patojen ilişkili moleküler desen olarak işlev bilinmektedir (PAMP) güçlü reseptör gibi Toll aracılığıyla doğuştan gelen tepkileri uyarmak için 3 (TLR3) interferon uyarılmış genlerin ekspresyonu ikna etmek için (ISGs)9,10,11,12,13,14. Son zamanlarda HDM toplam RNA dsRNA yapıları içerdiğini göstermiştir, Hangi ISGs ekspresyonu upregulated ve HDM özleri tarafından indüklenen alerjik astım bir murine modelinde intratrakeal instillasyon yoluyla uygulandığında şiddetli eozinofilik akciğer iltihabı azaltılmış15. Akciğer iltihaplarının şiddeti, bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer dokusunda kantisat hücre tiplerinin akış sitometrisi16,17,18,,19,20ile analiz edilerek belirlenir.
Bu protokol üç tahlil içerir: 1) rna nokta lekeli dsRNA yapılarının hızlı bir şekilde saptanması, özellikle dsRNA’ya (≥40bp) diziden bağımsız bir şekilde bağlanan bir fare monoklonal antikor J2 kullanarak; 2) RT-qPCR kullanarak ISG’lerin indüksiyonölçerek fare akciğerlerinde immünsülatör RNA in vivo etkileri için hızlı değerlendirilmesi; 3) hdm kaynaklı akciğer iltihabı bağlamında BAL ve akciğer eozinofiller doğru nicel akış sitometri analizi kullanarak.
Yukarıdaki tahliller sadece alerjik akciğer hastalıkları, aynı zamanda solunum bakteriyel ve viral enfeksiyonları incelemek için kullanılabilir. Örneğin, dsRNA spesifik J2 antikor da immünaffinity kromatografi, immünohistokimya, enzim ekine bağlı immünosorbent tsay (ELISA) ve immünostaining21,,22,23gibi diğer uygulamalarda kullanılabilir. Buna ek olarak, BAL sıvı toplama nın alt akışında, ELISA kullanarak sitokinler ve kemokinler gibi çözünür içeriğin ölçülmesi ve hava yollarında hücrelerin transkripsiyonel profilinin (örn. alveoler makrofajlar) ölçülmesi için çeşitli uygulamalar kullanılabilir. Literatürde akciğer koşullarını değerlendirmek için çeşitli protokoller bulunmasına rağmen, bu protokollerin çoğu genellikle hedef doğrulamaya odaklanır. Burada açıklanan prosedürler alerjik hastalıkların gelişimini düzenleyen önemli olan çevresel alerjenlerde bileşenleri belirlemek için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, alerjik astım bir fare modelinde alerjen ilişkili mikrobiyal RNA immünsiyonlaştırıcı özellikleri ve eozinofilik akciğer iltihabı gelişimi üzerindeki etkileri nasıl değerlendirilecektir açıklar. Uzun dsRNA’lar memeli hücrelerinde interferon yanıtlarını etkinhale getirebilen birçok virüsün replikasyon araları olarak bilinse de, HDM alerjenlerindeki varlıkları son çalışmamıza kadar bilinmemektedir15. Bu el yazmasında sunulan RNA nokta lekesi, RT-qPCR ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Karla Gorena’ya akış sitometrisinde teknik yardım için teşekkür ederiz. L.S. Çin Burs Konseyi ve Hunan İl İnovasyon Vakfı Lisansüstü (CX201713068) tarafından desteklenir. H.H.A. Klinik Laboratuvar Bilimleri Bölümü, Uygulamalı Tıp Bilimleri Koleji, Jouf Üniversitesi, Sakaka, Suudi Arabistan tarafından desteklenmiştir. X.D.L. UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund ve Max ve Minnei Voelcker Fund tarafından desteklenir.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
