I Vivo Målretning af Xenografted humane kræftceller med funktionaliserede fluorescerende Silica nanopartikler i zebrafisk

Summary

Beskrevet her er en metode til at udnytte zebrafisk embryoner til at studere evne til funktionaliserede nanopartikler til at målrette menneskelige kræftceller in vivo. Denne metode gør det muligt at evaluere og vælge optimale nanopartikler til fremtidige forsøg med store dyr og i kliniske forsøg.

Abstract

Udvikling af nanopartikler, der er i stand til at opdage, målrette og ødelægge kræftceller, er af stor interesse inden for nanomedicin. In vivo dyremodeller er nødvendige for at bygge bro over nanoteknologien til dens biomedicinske anvendelse. Musen repræsenterer den traditionelle dyremodel til prækliniske test; mus er dog relativt dyre at holde og har lange eksperimentelle cyklusser på grund af det begrænsede afkom fra hver mor. Zebrafisken har vist sig som et kraftfuldt modelsystem til udviklings- og biomedicinsk forskning, herunder kræftforskning. Især på grund af sin optiske gennemsigtighed og hurtige udvikling, zebrafisk embryoner er velegnet til real-time in vivo overvågning af adfærd kræftceller og deres interaktioner med deres mikromiljø. Denne metode blev udviklet til sekventielt at indføre humane kræftceller og funktionaliserede nanopartikler i gennemsigtige Casper zebrafisk embryoner og overvåge in vivo anerkendelse og målretning af kræftceller ved nanopartikler i realtid. Denne optimerede protokol viser, at fluorescerende mærket nanopartikler, som er funktionaliseret med folat grupper, kan specifikt genkende og målrette metastatisk human livmoderhalskræft kræftceller mærket med en anden fluorrom. Anerkendelse og målretning proces kan forekomme så tidligt som 30 min postinjektion af nanopartikler testet. Hele eksperimentet kræver kun avl af et par par voksne fisk og tager mindre end 4 dage at fuldføre. Desuden zebrafisk embryoner mangler en funktionel adaptive immunsystem, så engraftment af en bred vifte af menneskelige kræftceller. Derfor nytten af den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt at teste nanopartikler på forskellige typer af humane kræftceller, hvilket letter udvælgelsen af optimale nanopartikler i hver specifik kræftsammenhæng til fremtidige test i pattedyr og klinikken.

Introduction

Udviklingen af nanopartikler, der er i stand til at opdage, målrette og ødelægge kræftceller er af stor interesse for både fysikere og biomedicinske forskere. Fremkomsten af nanomedicin førte til udviklingen af flere nanopartikler, såsom dem, der er konjugeret med målretning ligands og / eller kemoterapeutiske lægemidler^1,,2,3. Nanopartiklernes ekstra egenskaber muliggør deres interaktion med det biologiske system, sensing og overvågning af biologiske hændelser med høj effektivitet og nøjagtighed sammen med terapeutiske anvendelser. Guld og jernoxid nanopartikler anvendes primært i computertomografi og magnetisk resonans imaging applikationer, henholdsvis. Mens enzymatiske aktiviteter af guld og jernoxid nanopartikler tillader påvisning af kræftceller gennem koloriumanalyser, fluorescerende nanopartikler er velegnet til in vivo billeddannelse applikationer⁴. Blandt dem, ultrabright fluorescerende nanopartikler er særligt gavnlige, på grund af deres evne til at opdage kræft tidligt med færre partikler og reduceret toksicitet⁵.

På trods af disse fordele kræver nanopartikler forsøg ved hjælp af in vivo-dyremodeller til udvælgelse af egnede nanomaterialer og optimering af synteseprocessen. Derudover, ligesom narkotika, nanopartikler stole på dyremodeller for prækliniske test for at bestemme deres effektivitet og toksicitet. Den mest udbredte prækliniske model er musen, som er et pattedyr, hvis vedligeholdelse kommer til en relativt høj pris. Til kræftundersøgelser anvendes enten gensplejsede mus eller xenografted mus typisk^6,7. Længden af disse eksperimenter spænder ofte fra uger til måneder. Især for kræft metastase undersøgelser, kræftceller injiceres direkte i kredsløbssygdomme af mus på steder såsom hale vener og milt^8,9,10. Disse modeller kun repræsenterer de afsluttende stadier af metastase, når tumorceller ekstravasate og kolonisere fjerne organer. Desuden, på grund af synlighed spørgsmål, Det er især udfordrende at overvåge tumor celle migration og nanopartikel målretning af tumorceller i mus.

Zebrafisk (Danio rerio) er blevet en kraftfuld hvirveldyr system til kræftforskning på grund af sin høje frugtbarhed, lave omkostninger, hurtig udvikling, optisk gennemsigtighed, og genetiske bevarelser^11,12. En anden fordel ved zebrafisk over musen model er befrugtning af fiskeæg ex utero, som gør det muligt for embryoner, der skal overvåges i hele deres udvikling. Embryonale udvikling er hurtig i zebrafisk, og inden for 24 timer efterfertilisering (hpf), hvirveldyr organ plan har allerede dannet¹³. Ved 72 hkf udklækkes æg fra chorion, der skifter fra embryonalen til yngelstadiet. Zebrafiskens gennemsigtighed, især Casper-stammen ^14,giver en enestående mulighed for at visualisere migrationen af kræftceller og deres anerkendelse og målretning af nanopartikler i et levende dyr. Endelig zebrafisk udvikle deres medfødte immunsystem med 48 hkf, med adaptive immunsystem halter bagefter og kun bliver funktionelle på 28 dage efterfertilisering¹⁵. Denne tidsforskel er ideel til transplantation af forskellige typer af humane kræftceller i zebrafisk embryoner uden at opleve immunafvisninger.

Beskrevet her er en metode, der udnytter zebrafiskens gennemsigtighed og hurtige udvikling til at demonstrere anerkendelse og målretning af humane kræftceller ved fluorescerende nanopartikler in vivo. I denne analyse, human livmoderhalskræft celler (HeLa celler) genetisk manipuleret til at udtrykke en rød fluorescerende protein blev injiceret i det vaskulære område i perivitelline hulrum af 48 hpf embryoner. Efter 20-24 timer havde HeLa-cellerne allerede spredt sig over embryonerne gennem fiskecirkulationssystemet. Embryoner med tilsyneladende metastase blev mikroindsprøjtet med ~ 0,5 nL af en nanopartikel opløsning direkte bag øjet, hvor den rige kapillær seng er placeret. Ved hjælp af denne teknik, ultrabright fluorescerende silica nanopartikler kan målrette HeLa celler så hurtigt som 20-30 min postinjektion. På grund af sin enkelhed og effektivitet repræsenterer zebrafisken en robust in vivo-model for at teste en række nanopartikler for deres evne til at målrette specifikke kræftceller.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Boston University School of Medicine under protokollen #: PROTO201800543. 1. Generation af Casper zebrafisk embryoner Vælg voksne Casper fisk, der er mindst 3 måneder gamle for naturlig avl for at generere gennemsigtige Casper zebrafisk embryoner. Fyld to-kammer parring tanke med fiskevand om aftenen, adskille de øverste tanke ved hjælp af skillevægge, p…

Representative Results

Protokolskemaet i figur 1 illustrerer de overordnede procedurer for denne undersøgelse. Gennemsigtige Casper mandlige og kvindelige voksne fisk blev avlet til at generere embryoner (afsnit 1). RFP+ HeLa-celler blev injiceret i det vaskulære område under zebrafiskembryonens perivitellinehulrum ved 48 hkf med ikke-injslede embryoner som kontrol (afsnit 3). For personer med erfaring i mikroinjektion er overlevelsesraten for embryoner ofte høj, og mi…

Discussion

Den protokol, der er beskrevet her, udnytter zebrafisken som et in vivo-system til at teste nanopartiklernes evne til at genkende og målrette metastatiske humane kræftceller. Flere faktorer kan påvirke en vellykket udførelse af forsøgene. For det første skal embryonerne udvikles fuldt ud ved 48 hk. Den korrekte udviklingsfase af embryonerne gør det muligt for dem at udholde og overleve transplantation af menneskelige kræftceller. Embryoner under 48 hk har en signifikant lavere overlevelsesrate sammenlignet med æ…

Materials

Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122