ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ
Summary
LEDで垂直に照射されたセットアップを用いて、難しい物質(着色物質やナノ材料など)に対する藻類毒性試験を実証しています。
Abstract
エコ毒性データは、欧州および国際規制(REACHなど)による化学物質の市場前および市場後の登録の要件です。藻類毒性試験は、化学物質の規制リスク評価に頻繁に使用されます。高い信頼性と再現性を実現するためには、標準化されたガイドラインの開発が不可欠です。藻類毒性試験では、ガイドラインには、pH、温度、二酸化炭素レベル、光強度などのパラメータの安定した均一な条件が必要です。ナノ材料やその他のいわゆる難しい物質は、光を妨げ、その規制の受け入れを妨げる結果の大きな変動を引き起こす可能性があります。これらの課題に対処するために、我々は、LEVITATT(藻類毒性試験用LED垂直照明テーブル)を開発しました。このセットアップでは、下からのLED照明を利用して、均質な光の分布と温度制御を可能にする一方で、サンプル内シェーディングを最小限に抑えます。このセットアップは、バイオマス定量のためにサンプル量を最適化し、同時に藻類の指数成長をサポートするために十分なCO2流入を保証します。さらに、テスト容器の材料は吸着および揮発を最小にするように合わせることができる。着色物質や粒子懸濁液をテストする場合、LEDライトの使用はまた、追加の発熱なしに光強度を増加させることができます。コンパクトデザインと最小限の設備要件により、幅広い研究所でのLEVITATTの実装の可能性が高まります。また、藻類毒性試験の標準化されたISOおよびOECDガイドラインに準拠する一方で、LEVITATTは、エルレンマイヤーフラスコおよびマイクロタイタープレートと比較して、2つの基準物質(3,5-ジホロロフェノールおよびK2 Cr2O7)および3ナノ材料(ZnO、CeO2、およびBaSO4)に対して、より低いサンプル間変動性を示した。2
Introduction
藻類毒性試験は、欧州および国際的な規制(REACH1およびTSCA(米国)による化学物質の市場前および後の登録に必要な生態毒性データを生成するために使用される3つの必須試験のうちの1つです。このため、標準化された藻類試験ガイドラインは、国際機関(ISOおよびOECDなど)によって開発されています。これらの試験基準とガイドラインは、pH、温度、二酸化炭素レベルおよび光強度の点で理想的な試験条件を規定する。しかし、藻類試験中の安定した試験条件の維持は、実際には困難であり、その結果、化学物質やナノ材料(しばしば「難しい物質」と呼ばれる)の範囲に対する再現性と信頼性に関する問題に苦しむ2。既存の藻類毒性試験の設定のほとんどは、インキュベーター内の軌道シェーカー上に位置する比較的大量(100〜250 mL)で動作します。このようなセットアップは、テスト濃度の数を制限し、達成可能な、藻類培養物および試験材料の大量を複製します。さらに、これらの設定は、均一な光場を持つことはほとんどなく、信頼性の高い照明条件は、光強度が指数関数的に減少し、一部は、フラスコの形状に起因する一部として、大きなフラスコで得ることはさらに困難です。代替設定は、pH、追加のバイオマス測定、顔料抽出または破壊的なサンプリングを必要とする他の分析を測定するのに十分なサンプリング量を許容しない小さなサンプル量を含むプラスチックマイクロチター3プレートを含む。着色懸濁液を形成するナノ材料および物質の藻類毒性試験のための既存の設定を用いた特定の課題の1つは、藻類細胞に利用可能な光の干渉または遮断であり、しばしば「シェーディング」4,5,5と呼ばれる。シェーディングは、試験材料および/または試験材料と藻体細胞との間の相互作用によってバイアル内で発生する可能性があり、または互いに対する位置と光源のためにバイアル間でシェーディングが発生する可能性があります。
この方法は、OECD 2017、およびISO8692 8などの規格に準拠した試験を可能にする、アレンスバーグら6によって導入された小規模藻類毒性試験セットアップに基づいている。この方法は、上記の制限に対処するためにさらに最適化されています: 1)LED光技術を利用して最小限の発熱で均一な光条件を確保し、2)一定のpH、CO2レベル、および3)揮発性2物質の試験や高い被光電位を有する汎用性の高い試験容器材料の使用を可能にしながら、化学的/生物学的分析のための十分なサンプル量を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物プランクトンは太陽エネルギーと二酸化炭素を有機物に変換し、水生生態系において極めて重要な役割を果たしています。このため、藻類増殖率阻害試験は、化学物質の規制リスク評価に必要な3つの必須の水生毒性試験の1つとして含まれています。信頼性が高く再現可能な藻類毒性試験を行う能力は、この点において重要です。アーレンマイヤーフラスコを使用したテスト設定では、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Horizon 2020の研究およびイノベーションプログラムの下で、PATROLS – ナノセーフティテストのための高度なツール、グラント契約760813によって資金提供されました。
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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