Uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis
Summary
Demonstramos testes de toxicidade de algas para substâncias difíceis (por exemplo, substâncias coloridas ou nanomateriais) usando uma configuração iluminada verticalmente com um LED.
Abstract
Os dados de ecotoxicidade são um requisito para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH). O teste de toxicidade de algas é frequentemente utilizado na avaliação de risco regulatório de produtos químicos. Para alcançar alta confiabilidade e reprodutibilidade, o desenvolvimento de diretrizes padronizadas é vital. Para testes de toxicidade alga, as diretrizes requerem condições estáveis e uniformes de parâmetros como pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. Nanomateriais e outras substâncias chamadas difíceis podem interferir com a luz causando uma grande variação nos resultados obtidos dificultando sua aceitação regulatória. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos o LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). A configuração utiliza a iluminação LED de baixo permitindo uma distribuição de luz homogênea e controle de temperatura, minimizando também o sombreamento intra-amostra. A configuração otimiza o volume amostral para quantificação de biomassa e, ao mesmo tempo, garante um influxo suficiente de CO2 para suportar o crescimento exponencial das algas. Além disso, o material dos recipientes de teste pode ser adaptado para minimizar a adsorção e a volatilização. Ao testar substâncias coloridas ou suspensões de partículas, o uso de luzes LED também permite aumentar a intensidade da luz sem geração adicional de calor. O design compacto e os requisitos mínimos de equipamentos aumentam as possibilidades de implementação do LEVITATT em uma ampla gama de laboratórios. Embora em conformidade com as diretrizes padronizadas do ISO e da OCDE para testes de toxicidade alga, a LEVITATT também mostrou uma menor variabilidade inter-amostra para duas substâncias de referência (3,5-Dicholorofenol e K2Cr2O7) e três nanomateriais (ZnO, CeO2e BaSO4) em comparação com frascos erlen e placas de microtídeos.
Introduction
O teste de toxicidade de algas é um dos três únicos testes obrigatórios utilizados para gerar os dados de ecotoxicidade necessários para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH1 e TSCA (EUA).” Para isso, foram desenvolvidas diretrizes padronizadas de testes de algas por organismos internacionais (por exemplo, ISO e OCDE). Estes padrões e diretrizes de teste prescrevem condições ideais de teste em termos de pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. No entanto, manter condições estáveis de teste durante os testes de algas é na prática difícil e os resultados sofrem de problemas com reprodutibilidade e confiabilidade para uma gama de substâncias químicas e nanomateriais (muitas vezes chamados de “substâncias difíceis”)2. A maioria das configurações de teste de toxicidade de algas existentes operam com volumes relativamente grandes (100-250 mL) situados em um agitador orbital dentro de uma incubadora. Tal configuração limita o número de concentrações de teste e replica volumes alcançáveis e altos de cultura alga e material de teste. Além disso, essas configurações raramente têm um campo de luz uniforme e condições de iluminação confiáveis são ainda mais difíceis de obter em frascos grandes, em parte à medida que a intensidade da luz diminui exponencialmente quanto mais a luz viaja e em parte devido à geometria do frasco. As configurações alternativas compreendem microtiter plástico3 placas contendo pequenos volumes de amostra que não permitem volumes de amostragem adequados para medir pH, medições adicionais de biomassa, extração de pigmento ou outras análises que requerem amostragem destrutiva. Um desafio particular usando as configurações existentes para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e substâncias que formam suspensões coloridas é a interferência ou bloqueio da luz disponível para as células algas, muitas vezes referidas como “sombreamento”4,,5. O sombreamento pode ocorrer dentro de frascos pelo material de teste e/ou interações entre o material de teste e as células algas, ou sombreamento pode ocorrer entre frascos, devido ao seu posicionamento em relação uns aos outros e à fonte de luz.
O método baseia-se na configuração do teste de toxicidade de algas em pequena escala introduzida por Arensberg et al.6 que permite testar em conformidade com normas como a OCDE 2017e ISO 86928. O método é ainda otimizado para atender às limitações acima indicadas por: 1) utilizando a tecnologia de luz LED para garantir condições uniformes de luz com geração mínima de calor, 2) fornecendo volume amostral adequado para análise química/biológica, mantendo pH constante, níveis de CO2 e 3) permitindo o uso de material de recipiente de teste versátil para testes de substâncias voláteis ou substâncias com alto potencial de sorção.
Protocol
Representative Results
Discussion
O fitoplâncton converte energia solar e dióxido de carbono em matéria orgânica e, portanto, tem um papel fundamental no ecossistema aquático. Por essa razão, os testes de inibição da taxa de crescimento de algas são incluídos como um dos três testes de toxicidade aquática obrigatórios necessários para a avaliação de risco regulatório de produtos químicos. A capacidade de realizar um teste de toxicidade algas confiável e reprodutível é fundamental nesse sentido. As configurações de teste usando fras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pela PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 sob o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
