Y-27632 Beriger udbyttet af humane melanocytter fra voksent hudvæv

Summary

Dette papir rapporterer, at tilsætningen af Y-27632 til TIVA medium kan øge udbyttet af melanocytter fra voksne hudvæv.

Abstract

Isolering og kultur af primære melanocytter fra hudvæv er meget vigtigt for biologisk forskning og har været meget udbredt til kliniske anvendelser. Isoler primære melanocytter fra hudvæv ved den konventionelle metode tager normalt omkring 3 til 4 uger at passage tilstrækkeligt. Endnu vigtigere, det anvendte væv er normalt nyfødte forskind og det er stadig en udfordring at effektivt isolere primære melanocytter fra voksne væv. Vi har for nylig udviklet en ny isolationsmetode for melanocytter, der tilføjer Y-27632, en Rho kinase hæmmer, til den oprindelige kultur medium for 48 h. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye metode dramatisk øger udbyttet af melanocytter og forkorter den tid, der kræves for at isolere melanocytter fra forhud væv. Vi beskriver nu denne nye metode mere detaljeret ved hjælp af voksen epidermis til effektivt at dyrke primære melanocytter. Vigtigere er det, vi viser, at melanocytter fremstillet af voksne væv fremstillet ved denne nye metode kan fungere normalt. Denne nye protokol vil i væsentlig grad gavne undersøgelser af pigmenteringsdefekter og melanomer ved hjælp af primære melanocytter fremstillet af let tilgængelige voksne hudvæv.

Introduction

Målet med denne undersøgelse var at udvikle en enkel og effektiv protokol til at isolere melanocytter fra epidermis af voksen hud til biologisk forskning og kliniske anvendelser. Melanocytter, som er placeret i den basale epidermis af huden og i hårsækkene, spiller en vigtig rolle i pigmentering af hud og hår ved at producere melanin¹. Den resulterende hudpigmentering fra epidermale melanocytter fungerer som et ultraviolet strålingsfilter, der reducerer/forhindrer DNA-skader på underliggende celler i huden². Den unormale spredning af melanocytter i huden er ret almindelig, såsom i dannelsen af godartede nevi (modermærker), hvor melanocytter potentielt omdanne til onkogen vækst efterfulgt af cellulære senescence³.

Siden 1957 har isolation og efterfølgende kultur af menneskelige primære melanocytter været muligt⁴, men først siden 1982 har der været en effektiv metode, der reproducerbart kan etablere kulturer af menneskelige melanocytter fra epidermis⁵. Den konventionelle metode til at isolere primære melanocytter fra epidermis indebærer en to-trins enzymatisk fordøjelse. Kort, huden er i første omgang fordøjet med dispase at adskille epidermis fra dermis, hvorefter epidermis er fordøjet med trypsin at producere suspensioner, der indeholder melanocytter og keratinocytter, som derefter kan selektivt dyrkes i forskellige medier. I øjeblikket tager den oprindelige kultur normalt omkring 3 til 4 uger for melanocytter at nå sammenløbet ved hjælp af den konventionelle metode, hvilket sandsynligvis skyldes den lave effektivitet af deres isolation. Derfor ville en forøgelse af den oprindelige produktion af melanocytter fra voksent hudvæv være ganske nyttigt for både laboratorieforskning og kliniske anvendelser.

Mange vækstfaktorer, hvoraf de fleste har vist sig at blive udskædt af keratinocytter (f.eks. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF og SCF)^5-8–8, regulerer differentiering og spredning af pattedyrsmelanocytter. I mangel af feeder lag, manglen på disse vækstfaktorer fører til nedsat spredning af melanocytter og deres øgede apoptose⁹. Co-kultur keratinocytter som feeder celler og melanocytter kunne føre til accelereret melanocyt spredning og reduceret apoptose. Men co-kultur metode ikke kun kræver mere hudvæv til at forberede keratinocytter, hvilket ikke er praktisk, men også kunne ikke arbejde effektivt, fordi de kulturbetingelser, der kræves af melanocytter ikke favoriserer keratinocyt vækst, og vice-versa.

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at tilsætning af Y-27632, en ROCK-hæmmer, i vækstmediet kan øge udbyttet af menneskelige primære epidermale celler fra hudvæv^10–14. Derfor ville det være interessant at teste, om isolering af menneskelige primære melanocytter ville drage fordel af tilstedeværelsen af Y-27632. Tilføjelsen af Y-27632 til inokulering TIVA medium¹⁵, som indeholder TPA, IBMX, Na₃VO₄ og dbcAMP, øgede faktisk udbyttet af primære melanocytter isoleret fra forhudvæv i de oprindelige kulturer¹⁶. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye protokol er betydeligt mere effektiv til at øge udbyttet af melanocytter¹⁶. Derfor beskriver denne protokol den nye metode i detaljer ved hjælp af voksen hudvæv baseret på en tidligere undersøgelse¹⁶ for at fremme dens anvendelse i grundlæggende og anvendt biologisk forskning.

Protocol

Brugen af voksenskindskind væv i denne protokol er blevet godkendt af Human Research Ethics Committee (Nr. 2015120401, dato: Maj 12, 2015). BEMÆRK: Udfør alle følgende procedurer i et sterilt miljø for at forhindre forurening af celler og kulturer. 1. Forberedelser Friske voksenhudevæv fra omskæringsoperationer i 15 ml rør indeholdende 10 ml fosfatstødpudesalt (PBS) og opbevares i 4 °C.BEMÆRK: Udskæn noget af vævene som beskrevet nedenfor …

Representative Results

Figur 1 viser et skematisk diagram, der sammenligner de konventionelle og de nye metoder. Proceduren for vævsfrembræmning og fordøjelse med den nye metode er den samme som proceduren for den konventionelle metode, idet den eneste forskel er, at de isolerede celler opslæmmes i 10 ml TIVA-medium i nærvær af 10 μM Y-27632. To dage efter såning, erstatte medierne med normal TIVA medium uden Y-27632. Den konventionelle metode til isolering primære melanocytter fra hudvæv kræver normalt…

Discussion

Den protokol, der er beskrevet her , var baseret på en nylig publikation¹⁶. Der bør lægges vægt på følgende kritiske trin for at opnå de bedste resultater med den nye metode. For det første, vellykket adskillelse af epidermis og dermis er afgørende. Skær den voksne forhud væv i 3-4 mm brede strimler ved hjælp af en skalpel klinge for at gøre dispase arbejde mere grundigt og nemt at adskille epidermis fra dermis. For det andet, når de adskiller disse to lag, forurening af dermis bør …

Materials

Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA）	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation