Y-27632 verrijkt de opbrengst van menselijke melanocyten uit volwassen huidweefsels
Summary
Dit document meldt dat de toevoeging van Y-27632 aan TIVA medium de opbrengst van melanocyten uit volwassen huidweefsels aanzienlijk kan verhogen.
Abstract
De isolatie en cultuur van primaire melanocyten uit huidweefsels is zeer belangrijk voor biologisch onderzoek en is op grote schaal gebruikt voor klinische toepassingen. Het isoleren van primaire melanocyten van huidweefsels volgens de conventionele methode duurt meestal ongeveer 3 tot 4 weken om voldoende te passeren. Wat nog belangrijker is, de gebruikte weefsels zijn meestal pasgeboren foreskins en het is nog steeds een uitdaging om efficiënt te isoleren primaire melanocyten van volwassen weefsels. We hebben onlangs een nieuwe isolatiemethode voor melanocyten ontwikkeld die Y-27632, een Rho kinase-remmer, toevoegt aan het oorspronkelijke kweekmedium voor 48 uur. Vergeleken met het conventionele protocol verhoogt deze nieuwe methode de opbrengst van melanocyten drastisch en verkort het de tijd die nodig is om melanocyten te isoleren van voorhuidweefsels. We beschrijven deze nieuwe methode nu in meer detail met behulp van volwassen opperhuid om efficiënt te cultuur primaire melanocyten. Belangrijk is dat we aantonen dat melanocyten verkregen uit volwassen weefsels bereid door deze nieuwe methode normaal kunnen functioneren. Dit nieuwe protocol zal aanzienlijk ten goede komen aan studies van pigmentatiedefecten en melanomen met behulp van primaire melanocyten bereid uit gemakkelijk toegankelijke volwassen huidweefsels.
Introduction
Het doel van deze studie was om een eenvoudig en effectief protocol te ontwikkelen om melanocyten te isoleren van de opperhuid van volwassen huid voor biologisch onderzoek en klinische toepassingen. Melanocyten, die zich bevinden in de basale opperhuid van de huid en in haarzakjes, spelen een belangrijke rol bij de pigmentatie van de huid en het haar door melanine1te produceren. De resulterende huidpigmentatie van epidermale melanocyten fungeert als een ultraviolet stralingsfilter dat DNA-schade aan onderliggende cellen in de huid vermindert/voorkomt2. De abnormale proliferatie van melanocyten in de huid is heel gebruikelijk, zoals in de vorming van goedaardige nevi (moedervlekken) waarbij melanocyten mogelijk transformeren tot oncogene groei, gevolgd door cellulaire senescentie3.
Sinds 1957 is het isolement en de daaropvolgende cultuur van menselijke primaire melanocyten mogelijk4, maar pas sinds 1982 is er een efficiënte methode die reproduceibly culturen van menselijke melanocyten kan vestigen uit de opperhuid5. De conventionele methode om primaire melanocyten te isoleren van de opperhuid omvat een tweestapszymatische spijsvertering. Kortom, de huid wordt in eerste instantie verteerd met dispase om de opperhuid van de dermis te scheiden, waarna de opperhuid wordt verteerd met trypsine om suspensieën met melanocyten en keratinocyten te produceren, die vervolgens selectief kunnen worden gekweekt in verschillende media. Momenteel duurt de initiële cultuur meestal ongeveer 3 tot 4 weken voordat melanocyten samenvloeiing bereiken met behulp van de conventionele methode, wat waarschijnlijk te wijten is aan de lage efficiëntie van hun isolatie. Daarom zou het verhogen van de initiële productie van melanocyten uit volwassen huidweefsels heel nuttig zijn voor zowel laboratoriumonderzoek als klinische toepassingen.
Veel groeifactoren, waarvan de meeste zijn aangetoond dat ze worden afgescheiden door keratinocyten (bijvoorbeeld α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF en SCF)5–8, reguleren de differentiatie en proliferatie van zoogdiermeloolieten. Bij afwezigheid van feederlagen leidt het ontbreken van deze groeifactoren tot de verminderde proliferatie van melanocyten en hun verhoogde apoptose9. De co-cultuur van keratinocyten als feedercellen en melanocyten zou kunnen leiden tot versnelde melanocytenproliferatie en verminderde apoptose. Echter, de co-cultuur methode vereist niet alleen meer huidweefsels voor te bereiden keratinocyten, die niet praktisch is, maar ook niet efficiënt zou kunnen werken, omdat de cultuur voorwaarden vereist door melanocyten niet voorstander van keratinocyten groei, en vice versa.
Eerdere studies hebben gemeld dat de toevoeging van Y-27632, een ROCK-remmer, in het groeimedium de opbrengst van menselijke primaire epidermale cellen uit huidweefsels10–14kan verbeteren. Daarom zou het interessant zijn om te testen of de isolatie van menselijke primaire melanocyten zou profiteren van de aanwezigheid van Y-27632. De toevoeging van Y-27632 in het inentings TIVA medium15, dat TPA, IBMX, Na3VO4 en dbcAMP bevat, verhoogde de opbrengst van primaire melanocyten geïsoleerd uit voorhuidweefsels in de oorspronkelijke culturen16. In vergelijking met het conventionele protocol is dit nieuwe protocol aanzienlijk efficiënter in het verhogen van de opbrengst van melanocyten16. Daarom beschrijft dit protocol de nieuwe methode in detail met behulp van volwassen huidweefsels op basis van een eerdere studie16 om de toepassing ervan in fundamenteel en toegepast biologisch onderzoek te bevorderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol was gebaseerd op een recente publicatie16. Er moet enige aandacht worden besteed aan de volgende kritieke stappen om met de nieuwe methode de beste resultaten te bereiken. Ten eerste is een succesvolle scheiding van de opperhuid en de dermis cruciaal. Snijd de volwassen voorhuidweefsels in 3-4 mm brede stroken met behulp van een scalpelblad om de dispase grondiger en gemakkelijker te laten werken om de opperhuid van de dermis te scheiden. Ten tweede, bij het scheiden v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door The National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36)) en The Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2019GSF108107) aan X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) en De Fundamentele Onderzoeksfondsen van de Shandong University (2019GN043) aan J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. Human melanocytes in tissue culture. Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
