Y-27632 Beriker utbyttet av menneskelige melanocytter fra voksen hudvev

Summary

Dette papiret rapporterer at tillegg av Y-27632 til TIVA medium kan øke utbyttet av melanocytter fra voksen hudvev.

Abstract

Isolasjonen og kulturen til primære melanocytter fra hudvev er svært viktig for biologisk forskning og har vært mye brukt til kliniske applikasjoner. Isolere primære melanocytter fra hudvev ved den konvensjonelle metoden tar vanligvis ca 3 til 4 uker å passere tilstrekkelig. Enda viktigere, vevet som brukes er vanligvis nyfødte forhuder, og det er fortsatt en utfordring å effektivt isolere primære melanocytter fra voksent vev. Vi har nylig utviklet en ny isolasjonsmetode for melanocytter som legger Y-27632, en Rho kinase hemmer, til det første kulturmediet i 48 h. Sammenlignet med den konvensjonelle protokollen, øker denne nye metoden dramatisk utbyttet av melanocytter og forkorter tiden som kreves for å isolere melanocytter fra forhudsvev. Vi beskriver nå denne nye metoden mer detaljert ved hjelp av voksen epidermis for å effektivt kultur primære melanocytter. Viktigere viser vi at melanocytter hentet fra voksent vev utarbeidet av denne nye metoden kan fungere normalt. Denne nye protokollen vil betydelig nytte studier av pigmentering defekter og melanomer ved hjelp av primære melanocytter utarbeidet fra lett tilgjengelig voksen hud vev.

Introduction

Målet med denne studien var å utvikle en enkel og effektiv protokoll for å isolere melanocytter fra epidermis av voksen hud for biologisk forskning og kliniske applikasjoner. Melanocytter, som ligger i basal epidermis i huden og i hårsekkene, spiller en viktig rolle i pigmentering av hud og hår ved å produsere melanin¹. Den resulterende hudpigmentering fra epidermale melanocytter fungerer som et ultrafiolett strålingsfilter som reduserer/forhindrer DNA-skade på underliggende celler i huden². Unormal spredning av melanocytter i huden er ganske vanlig, for eksempel i dannelsen av godartede nevi (mol) der melanocytter potensielt forvandles til onkogen vekst etterfulgt av cellulær senescence³.

Siden 1957 har isolasjonen og den påfølgende kulturen av humane primære melanocytter vært mulig⁴, men bare siden 1982 har det vært en effektiv metode som kan reproduserende etablere kulturer av menneskelige melanocytter fra epidermis⁵. Den konvensjonelle metoden for å isolere primære melanocytter fra epidermis innebærer en to-trinns enzymatisk fordøyelse. Kort, huden er i utgangspunktet fordøyd med dispase å skille epidermis fra dermis, hvoretter epidermis er fordøyd med trypsin å produsere suspensjoner som inneholder melanocytter og keratinocytter, som deretter kan selektivt dyrkes i forskjellige medier. For tiden tar den første kulturen vanligvis ca 3 til 4 uker for melanocytter for å nå samløpet ved hjelp av den konvensjonelle metoden, noe som sannsynligvis skyldes den lave effektiviteten av isolasjonen. Derfor, øke den første produksjonen av melanocytter fra voksen hud vev ville være ganske nyttig for både laboratorieforskning og kliniske applikasjoner.

Mange vekstfaktorer, hvorav de fleste har vist seg å være utskilt av keratinocytter (f.eks. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF og SCF)^5–8, regulere differensiering og spredning av pattedyr melancytter. I fravær av materlag fører mangelen på disse vekstfaktorene til redusert spredning av melanocytter og deres økte apoptose⁹. Co-kulturen av keratinocytter som mater celler og melanocytter kan føre til akselerert melanocytt spredning og redusert apoptose. Imidlertid krever co-kultur metoden ikke bare mer hudvev for å forberede keratinocytter, som ikke er praktisk, men heller ikke kunne fungere effektivt fordi kulturforholdene som kreves av melanocytter ikke favoriserer keratinocyttvekst, og omvendt.

Tidligere studier har rapportert at tillegg av Y-27632, en ROCK-hemmer, inn i vekstmediet kan forbedre utbyttet av menneskelige primære epidermale celler fra hudvev^10–14. Derfor ville det være interessant å teste om isolering av menneskelige primære melanocytter ville ha nytte av tilstedeværelsen av Y-27632. Faktisk, tillegg av Y-27632 i inokulasjonen TIVA medium¹⁵, som inneholder TPA, IBMX, Na₃VO₄ og dbcAMP, betydelig økt utbyttet av primære melanocytter isolert fra forhudsvev i de første kulturer¹⁶. Sammenlignet med den konvensjonelle protokollen, er denne nye protokollen betydelig mer effektiv i å øke utbyttet av melanocytter¹⁶. Derfor beskriver denne protokollen den nye metoden i detalj ved hjelp av voksent hudvev basert på en tidligere studie¹⁶ for å fremme anvendelsen i grunnleggende og anvendt biologisk forskning.

Protocol

Bruken av voksent forhudsvev i denne protokollen er godkjent av Human Research Ethics Committee (nr. 2015120401, dato: 12. mai 2015). MERK: Utfør alle følgende prosedyrer i et sterilt miljø for å forhindre kontaminering av celler og kulturer. 1. Forberedelser Samle fersk voksen forhud vev fra omskjæring operasjoner i 15 ml rør som inneholder 10 ml fosfat buffer saltvann (PBS) og lagre i 4 °C.MERK: Skill vevet som beskrevet nedenfor innen 24 time…

Representative Results

Figur 1 viser et skjematisk diagram som sammenligner de konvensjonelle og de nye metodene. Prosedyren for vevsforberedelse og fordøyelse med den nye metoden er den samme som prosedyren for den konvensjonelle metoden, den eneste forskjellen er at de isolerte cellene er resuspended i 10 ml TIVA medium i nærvær av 10 μM Y-27632. To dager etter seeding, erstatte media med normal TIVA medium uten Y-27632. Den konvensjonelle metoden for å isolere primære melanocytter fra hudvev krever vanlig…

Discussion

Protokollen som er beskrevet her var basert på en nylig publikasjon¹⁶. Noe oppmerksomhet bør rettes mot følgende kritiske trinn for å oppnå de beste resultatene med den nye metoden. Først er vellykket separasjon av epidermis og dermis avgjørende. Skjær det voksne forhudsvevet i 3-4 mm brede strimler ved hjelp av et skalpellblad for å få dispase til å fungere grundigere og lettere for å skille epidermis fra dermis. For det andre, når du skiller disse to lagene, bør forurensning av der…

Materials

Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA）	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation