Y-27632 Berikar avkastningen av mänskliga melanocyter från vuxna hudvävnader

Summary

Detta dokument rapporterar att tillägg av Y-27632 till TIVA medium kan avsevärt öka avkastningen av melanocyter från vuxna hudvävnader.

Abstract

Isolering och kultur av primära melanocyter från hudvävnader är mycket viktigt för biologisk forskning och har använts i stor utsträckning för kliniska tillämpningar. Isolera primära melanocyter från hudvävnader med den konventionella metoden tar vanligtvis ca 3 till 4 veckor att passera tillräckligt. Ännu viktigare, de vävnader som används är oftast nyfödda förhud och det är fortfarande en utmaning att effektivt isolera primära melanocyter från vuxna vävnader. Vi har nyligen utvecklat en ny isoleringsmetod för melanocyter som lägger till Y-27632, en Rho kinashämmare, till det ursprungliga odlingsmediet för 48 h. Jämfört med det konventionella protokollet ökar denna nya metod dramatiskt avkastningen av melanocyter och förkortar den tid som krävs för att isolera melanocyter från förhudsvävnader. Vi beskriver nu denna nya metod mer i detalj med hjälp av vuxna epidermis att effektivt kultur primära melanocyter. Viktigt är att vi visar att melanocyter som erhållits från vuxna vävnader som utarbetats av denna nya metod kan fungera normalt. Detta nya protokoll kommer avsevärt att gynna studier av pigmentering defekter och melanom med hjälp av primära melanocyter som utarbetats från lättillgängliga vuxna hudvävnader.

Introduction

Målet med denna studie var att utveckla ett enkelt och effektivt protokoll för att isolera melanocyter från epidermis av vuxen hud för biologisk forskning och kliniska tillämpningar. Melanocyter, som ligger i den basala epidermis av huden och i hårsäckarna, spelar en viktig roll i pigmentering av hud och hår genom att producera melanin¹. Den resulterande hudpigmentering från epidermal melanocyter fungerar som en ultraviolett strålning filter som minskar / förhindrar DNA-skador på underliggande celler i huden². Den onormala spridningen av melanocyter i huden är ganska vanligt, såsom i bildandet av godartade nevi (mol) där melanocyter potentiellt förvandlas till onkogen tillväxt följt av cellulär senescens³.

Sedan 1957 har isolering och efterföljande kultur av mänskliga primära melanocyter varit möjligt⁴, men först sedan 1982 har det funnits en effektiv metod som reproducerbart kan etablera kulturer av mänskliga melanocyter från epidermis⁵. Den konventionella metoden för att isolera primära melanocyter från epidermis innebär en två steg enzymatisk matsmältning. Kortfattat är huden först smält med dispase att skilja epidermis från dermis, varefter epidermis rötas med trypsin att producera suspensioner som innehåller melanocyter och keratinocyter, som sedan kan selektivt odlas i olika medier. För närvarande tar den ursprungliga kulturen vanligtvis ca 3 till 4 veckor för melanocyter att nå sammanflödet med den konventionella metoden, vilket sannolikt beror på den låga effektiviteten i deras isolering. Därför skulle öka den ursprungliga produktionen av melanocyter från vuxna hudvävnader vara till stor hjälp för både laboratorieforskning och kliniska tillämpningar.

Många tillväxtfaktorer, varav de flesta har visat sig utsöndras av keratinocyter (t.ex. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF och SCF)^5–8, reglerar differentiering och spridning av däggdjur melanocyter. I avsaknad av matarlager leder bristen på dessa tillväxtfaktorer till den minskade spridningen av melanocyter och deras ökade apoptos⁹. Samodlingen av keratinocyter som matarceller och melanocyter kan leda till accelererad melanocyte spridning och minskad apoptos. Men samkulturmetoden kräver inte bara fler hudvävnader för att förbereda keratinocyter, vilket inte är praktiskt, men också inte kunde fungera effektivt eftersom de kulturförhållanden som krävs av melanocyter inte gynnar keratinocyttillväxt, och vice versa.

Tidigare studier har rapporterat att tillägg av Y-27632, en ROCK-hämmare, i tillväxtmediet kan öka avkastningen av mänskliga primära epidermala celler från hudvävnader^10–14. Därför skulle det vara intressant att testa om isoleringen av mänskliga primära melanocyter skulle dra nytta av förekomsten av Y-27632. Faktum är att tillägg av Y-27632 i inokulering TIVA medium¹⁵, som innehåller TPA, IBMX, Na₃VO₄ och dbcAMP, avsevärt ökat avkastningen av primära melanocyter isolerade från förhud vävnader i de ursprungliga kulturerna¹⁶. Jämfört med det konventionella protokollet är detta nya protokoll betydligt effektivare när det gäller att öka avkastningen av melanocyter¹⁶. Därför beskriver detta protokoll den nya metoden i detalj med hjälp av vuxna hudvävnader baserade på en tidigare studie¹⁶ för att främja dess tillämpning i grundläggande och tillämpad biologisk forskning.

Protocol

Användningen av vävnader från för vuxna i detta protokoll har godkänts av kommittén för humanforskningsetik (nr 2015120401, datum: 12 maj 2015). OBS: Utför alla följande procedurer i en steril miljö för att förhindra kontaminering av celler och kulturer. 1. Förberedelser Samla färska vuxna förhudsvävnader från omskärelseoperationer i 15 ml-rör som innehåller 10 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS) och förvara i 4 °C.OBS: Separera v?…

Representative Results

Figur 1 visar ett schema som jämför de konventionella och de nya metoderna. Förfarandet för vävnadsberedning och matsmältning med den nya metoden är detsamma som förfarandet för den konventionella metoden, den enda skillnaden är att de isolerade cellerna återanvänds i 10 ml TIVA-medium i närvaro av 10 μM Y-27632. Två dagar efter sådd, ersätta mediet med normalt TIVA medium utan Y-27632. Den konventionella metoden för att isolera primära melanocyter från hudvävnader kräv…

Discussion

Det protokoll som beskrivs här baserades på en nyligen publicerad¹⁶. Viss uppmärksamhet bör ägnas åt följande kritiska steg för att uppnå bästa resultat med den nya metoden. För det första är framgångsrik separation av epidermis och dermis avgörande. Skär den vuxna förhuden vävnader i 3-4 mm breda remsor med hjälp av en skalpell blad för att göra dispas arbete mer noggrant och enkelt att skilja epidermis från dermis. För det andra, när separera dessa två lager, bör kontam…

Materials

Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A21203	For Immunofluorescence
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	R37119	For Immunofluorescence
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
15 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
50 mL Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
DAPI	Abcam	ab104139	For Immunofluorescence
Dispase	Gibco	17105-041	For melanocyte isolation
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
Fluorescence microscope	Olympus	5E44316	For Immunofluorescence
Forskolin	MCE	HY-15371	Induce pigmentation
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	melanocyte culture medium
Ham's F12	Thermo Scientific	11330032	melanocyte culture medium
Inverted microscope	Olympus	5C42258	For cell microscopic observation
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)	Sigma	17018	melanocyte culture medium
mouse anti-human MITF	Abcam	ab12039	For Immunofluorescence
Na3VO4	Sigma	S6508	melanocytes culture medium
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP)	Sigma	D0627	melanocyte culture medium
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA）	Sigma	79346	melanocyte culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
rabbit anti-human Ki-67	Abcam	ab15580	For Immunofluorescence
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifugation
TC20TM automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Automatic cell counting
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For melanocyte dissociation
Y-27632	Sigma	Y0503	For melanocyte isolation