Vi præsenterer en protokol ved hjælp af høj opløsning mikro-computertomografi billedbehandling at afgøre, om rumflyvning induceret skade på okulære strukturer. Protokollen viser mikro-CT-afledt måling af ex vivo gnaver okulære strukturer. Vi demonstrerer evnen til at vurdere okulære morfologiske ændringer efter rumflyvning ved hjælp af en ikke-destruktiv tridimensional teknik til at vurdere øjenskader.
Rapporter viser, at langvarig eksponering for et rumflyvningsmiljø medfører morfologiske og funktionelle oftalmologiske ændringer i astronauter under og efter en international rumstation (ISS) mission. De underliggende mekanismer i disse rumflyvningsinducerede ændringer er imidlertid på nuværende tidspunkt ukendte. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme rumflyvningsmiljøets indvirkning på okulære strukturer ved at evaluere tykkelsen af musethinden, nethindepigmentepitel (RPE), choroid og scleralaget ved hjælp af mikro-CT-billeddannelse. Ti uger gamle C57BL/6 mandlige mus blev anbragt ombord på ISS for en 35-dages mission og derefter vendte tilbage til Jorden i live til vævsanalyse. Til sammenligning blev jordkontrolmus (GC) på Jorden opretholdt under identiske miljøforhold og hardware. Okulære vævsprøver blev indsamlet til mikro-CT-analyse inden for 38(±4) timer efter splashdown. Billederne af tværsnittet af nethinden, RPE, choroid, og sclera lag af det faste øje blev registreret i en aksial og sagittal visning ved hjælp af en mikro-CT imaging erhvervelse metode. Mikro-CT-analysen viste, at tværsnitsområderne i nethinden, RPE og choroidlagtykkelsen blev ændret i rumflyvningsprøver sammenlignet med GC, hvor rumflyvningsprøver viste betydeligt tyndere tværsnit og lag sammenlignet med kontroller. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at mikro-CT evaluering er en følsom og pålidelig metode til at karakterisere okulære struktur ændringer. Disse resultater forventes at forbedre forståelsen af miljøbelastningens indvirkning på de globale okulære strukturer.
I rumflyvningens mikrotyngdekraftsmiljø kan øget intrakranielt tryk (ICP) forårsaget af væskeskift have bidraget til rumflyvnings-associeret neuro-okulært syndrom (SANS)1,2,3,4,5. Faktisk har over 40% af astronauter oplevet SANS under og efter en International Space Station (ISS) mission6, herunder rumflyvning genstand for NASA Twins Study7. Den nuværende patofysiologi af SANS omfatter fysiologiske ændringer såsom optisk disk ødem, kloden udfladning, choroidal og retinale folder, hyperopiske brydning fejlskift, og nervefiber lag infarkter (dvs. vat pletter) og er veldokumenteret5,8. De underliggende mekanismer i de ændringer og faktorer, der bidrager til udviklingen af skader, er imidlertid uklare. For at få en bedre forståelse af SANS, dyremodeller er tilgængelige for at karakterisere rumflyvning-associerede ændringer i retinale struktur og funktion.
I en tidligere undersøgelse af de samme dyr, rapporterede vi virkningen af 35 dages rumflyvning på musen nethinden. Resultaterne belyse, at rumflyvning inducerer betydelig skade i nethinden og retinal vaskulatur, og nogle proteiner / veje forbundet med celledød, inflammation og metabolisk stress blev væsentligt ændret efter rumflyvning9.
I øjeblikket er der en række noninvasive imaging teknikker etableret for at overvåge sygdomsudvikling og progression, samt fysiologiske reaktioner på forskellige miljømæssige stressfaktorer, som også er meget udbredt i små gnavere modeller. En af disse teknikker er mikro-CT, som evaluerer anatomiske strukturer og patologiske processer, og har med succes været anvendt på organismer så små som mus10.
Mikro-CT kan opnå en mikrosized opløsning, og det kan give høj kontrast til volumetrisk analyse af blødt væv med tilføjelse af den relevante kontrastmiddel10,11,,12,13,14. Mikro-CT-teknologi er fordelagtig i forhold til traditionelle metoder såsom grov anatomi, lys mikroskopi, og histologi undersøgelse, da det minimerer fysisk skade på den geometriske profil af prøverne og ændrer ikke det rumlige forhold mellem strukturer. Desuden kan tre-dimensionelle (3D) modeller af strukturer rekonstrueres fra mikro-CT-billeder12,14. Til dato, på trods af dokumentation for synsnedsættelse efter eksponering for rummiljøet, er der kun få data i dyremodeller til rådighed for en bedre forståelse af rumflyvningsrelaterede ændringer i retinale struktur og funktion. I den nuværende undersøgelse blev mus fløjet på en 35-dages mission ombord på ISS for at bestemme rumflyvningsmiljøets indvirkning på okulære vævsstrukturer ved at kvantificere mikrostrukturen i nethinden, RPE og choroidlagene ved hjælp af mikro-CT.
Resultaterne af denne undersøgelse viste, at der var strukturelle ændringer i rumflyvning mus øjet ved hjælp af mikro-CT teknik i forhold til GC grupper, især af nethinden, RPE, og choroid lag af øjet, som det fremgår af deres nedsat tykkelse. Micro-CT giver en effektiv og ikke-destruktiv teknik til at karakterisere ændringerne uden behov for manipulation. Brugen af PMA farvning forbedret kvaliteten af mikro-CT billeder til at opnå klare 3D tomografiske billeder efter rekonstruktion, ovenstående ethvert behov for fysisk at ændre strukturen af prøven. En ekstra fordel ved disse billeder er, at de viser hele interesseområdet digitalt, hvilket øger tilgængeligheden samt reproducerbarheden af resultaterne. Gennem mikro-CT-billeder produceret i løbet af denne undersøgelse, den målrettede prøve viste differentiering af de mange strukturer som nethinden, RPE, choroid, og sclera lag til bestemmelse af tykkelsen af hvert lag.
Et kritisk skridt i protokollen er manipulation af prøverne på grund af deres størrelse og tekstur. Håndteringen af prøven skal udføres omhyggeligt uden at lægge pres på prøven under præparatet. Mikro-CT har nogle begrænsninger: opløsning og manglen på standardiserede værdier for parametrene. Under scanningen kan de forskellige mikro-CT-scannere have forskellige billedbehandlingsalgoritmer; alligevel kalibrering for en gråtoner kan forfølges for at overvinde ethvert problem. Efter scanning, rekonstruktion af billederne bør være baseret på væv og den analyse, der vil blive udført. Det kan være kritisk, da billedkvaliteten afhænger af det tomografiske system, indstillingerne, prøvestørrelsen samt tilberedningsmetoderne16,17.
På grund af sin vellykkede anvendelse i at studere flere typer af normale og patologiske væv, mikro-CT billeddannelse kapaciteter bør anvendes i fremtidig forskning til at udarbejde volumetriske data til andre analyser. På grundlag af denne undersøgelses formål var det således acceptabelt at anvende bidimensionale målinger, men segmentering af brutto3D-strukturen kan også være gavnligt at give en præcis oversigt over hele prøven. Selv med alle fordelene ved en ikke-destruktiv teknik, mikro-CT vil ikke erstatte andre metoder såsom immunohistochemistry, men vil supplere og tillade efterfølgende histologi analyser, hvis det ønskes.
En langvarig rumflyvning tilstand producerer en række strukturelle og funktionelle okulære ændringer i astronauterne under og efter rummission defineret som SANS. Resultaterne omfatter hyperopiske skift, kloden udfladning, choroidal / retinal folder, og vat pletter19. I modsætning til astronauternes optiske sammenhæng tomografi (OCT) konstatering af retinale nerve fiber lag fortykkelse, udtynding af nethinden og choroidal lag blev dokumenteret i dette dyr mikro-CT-undersøgelse. Disse resultater var uventede. Denne uoverensstemmelse kan skyldes konfunderende faktorer. Mus har begrænset cephalad væske skift i forhold til mennesker. Denne mangel på væskeskift kan have fremkaldt forskellige reaktioner på tyngdekraftsændringer. For det andet blev mus dissekeret inden for 38 timer efter stænk ned, og en akut respons for re-tilpasning kan også bidrage til morfologiske ændringer i nethinden og choroid. Bekræftelse af denne mulighed kræver yderligere målinger under rumflyvning og lang sigt efter missionen.
Resultaterne af denne undersøgelse viser, at rumflyvningsforhold, især gravitationelle ændringer, kan fremkalde en akut og kortsigtet respons i øjet. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastslå konsekvenserne af de akutte ændringer på okulær på retinale funktion og mekanisme af rumflyvning-induceret struktur ændringer.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af NASA Space Biology grant # NNX15AB41G og LLU Institut for Grundlæggende Videnskaber. Sungshin Choi, Dennis Leveson og Rebecca Klotz bidrog væsentligt til succesen med vores rumflyvningsundersøgelse, og vi sætter stor pris på deres støtte. Forfatterne vil også gerne takke hele NASA Biospecimen Sharing Program gruppe for deres store hjælp.
Forfatterne vil også gerne takke Center for Dental Research for Micro-CT service.
10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |