Isolering af fedtvævskerner til enkeltcellegenroriske anvendelser
Summary
Denne publikation beskriver en protokol for isolering af kerner fra modne adipocytter, rensning ved fluorescensaktiveret sortering og enkeltcelleniveausekripteromics.
Abstract
Brunt og beige fedt er specialiserede fedtvæv, der spreder energi til termogenese ved UCP1 (Afkobling Protein-1)-afhængige og uafhængige veje. Indtil for nylig blev termogeniske adipocytter betragtet som en homogen population. Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at der er flere undertyper eller delpopulationer, der er forskellige i udviklingsmæssig oprindelse, substratbrug og transskription. På trods af fremskridt inden for encellede genomforskning har uvildig nedbrydning af fedtvæv i cellulære undertyper været udfordrende på grund af den skrøbelige karakter af lipidfyldte adipocytter. Den fremlagte protokol blev udviklet for at omgå disse hindringer ved effektiv isolering af enkelte kerner fra fedtvæv til downstream-applikationer, herunder RNA-sekvensering. Cellulær heterogenitet kan derefter analyseres ved RNA-sekvensering og bioinformatikanalyser.
Introduction
Undersøgelser har vist, at brunt fedtvæv (BAT) har en bemærkelsesværdig evne til at sprede energi. Der findes to typer termogeniske adipocytter med forskellige udviklingsmæssige træk hos både gnavere og mennesker: beige adipocytter og klassiske brune adipocytter. Mens klassiske brune adipocytter er placeret for det meste i interscapular BAT depoter, beige adipocytter sporadisk dukke op i hvidt fedtvæv (WAT) som reaktion på visse fysiologiske signaler, såsom kronisk kold eksponering, en proces benævnt “bruning” eller “beiging”. Ved hjælp af avanceret billeddannelse står det nu klart, at voksne mennesker har betydelige depoter af UCP1+ BAT, især i den supraclavicular region1,,2,,3,4. Mængden af voksne humane BAT omvendt korrelerer med adiposity og kan øges ved eksterne signaler, såsom kronisk kold eksponering5,,6 eller β3-adrenerge receptor agonist7. BAT-medieret energiforbrug kan være en holdbar tilgang til bekæmpelse af fedme.
Indtil for nylig er termogeniske adipocytter blevet betragtet som en homogen population. Undersøgelser har imidlertid vist, at der findes flere undertyper eller delpopulationer, der er forskellige i udviklingsmæssig oprindelse, substratbrug og transskription8,9,10. For eksempel, en type beige adipocyt, der fortrinsvis bruger glukose til termogenese, den g-beige adipocyt, blev for nylig beskrevet10. Den ufuldstændige forståelse af celletyper i brunt og beige fedtvæv og manglen på specifikke markører udgør en kritisk hindring for at studere deres biologiske funktioner.
Traditionelle metoder til at isolere delpopulationer af celler er baseret på ekspression af kun nogle få kendte markørgener. Nylige fremskridt inden for encellet genomforskning gør det muligt at anvende globale genekspressionsdata for enkelte celler for at give et objektivt skøn over antallet af delpopulationer i et væv. Det endelige mål med denne protokol er at bestemme alle fedtvævsundertyper under forskellige termogeniske stimuli ved en enkelt celleopløsning. I modsætning til andre væv og celletyper, bestemmelse cellulære undertyper af fedtvæv er udfordrende på grund af skrøbelighed lipid-fyldte adipocytter. Dette papir introducerer en robust protokol til at isolere enkelte kerner fra fedtvæv til downstream ansøgning til snRNA sekventering. Det er vigtigt, at den seneste litteratur, der sammenligner velmatchede single-nuclei RNA-sekvensering (snRNA-seq) og enkeltcelle-RNA-sekvensering (scRNA-seq) datasæt, viste, at snRNA-seq kan sammenlignes med scRNA-seq i celletypedetektion og overlegen i cellulær dækning for et komplekst væv som hjernen11. Denne protokol kombinerer en tæthed gradient centrifugering metode optimeret til fedtvæv af Rosen et al.12 med en kerne “oprydning” trin med en MoFlo XDP High Speed Sorter. Som det ses i de repræsentative resultater, en analyse af 7.500 enkelt kerner fra mus interscapular brun fedtvæv identificeret flere celletyper inden tilsyneladende homogene brune adipocytter. Samlet set kan denne enkle og robuste protokol anvendes til at studere væv-niveau organisering af adipocytter og fedt-hjemmehørende celler, identifikation af subtype-specifikke markør gener, og udvikling fænotypebestemmelse af fedt-selektiv knockout / transgene mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enkel og robust metode til at isolere enkelte kerner og studere fedtvæv heterogenitet præsenteres. Sammenlignet med hele væv RNA sekventering, denne arbejdsgang giver en upartisk visning af cellulære heterogenitet og befolkningsspecifikke markører. Dette er vigtigt og innovativt for fremme af adipocyt biologi, molekylær metabolisme, og fedme forskning.
Denne protokol er især optimeret til downstream anvendelse af snRNA-seq. Den “oprydning” skridt for at opnå isolering af sunde kerne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke David Reynolds fra Albert Einstein Genomics kerne og Jinghang Zhang fra Flow Cytometry Core for teknisk support. Vi anerkender støtte fra National Institutes of Health (NIH) (DK110426) og Pilot og Feasibility Grants fra Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) og New York Obesity Research Center (DK026687) (alt sammen til K.S.). Vi vil også gerne takke Albert Einstein Cancer Center (CA013330) for kernestøtte.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
