Summary

Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Published: June 12, 2020
doi:

Summary

Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.

Abstract

Braunes und beiges Fett sind spezialisierte Fettgewebe, die Energie für die Thermogenese durch UCP1 (Uncoupling Protein-1) abhängige und unabhängige Wege ableiten. Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass es mehrere Subtypen oder Subpopulationen gibt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratverwendung und Transkriptom unterscheiden. Trotz der Fortschritte in der einzelligen Genomik war die unvoreingenommene Zersetzung von Fettgeweben in zelluläre Subtypen aufgrund der zerbrechlichen Natur von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Das vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um diese Hindernisse durch eine effektive Isolierung einzelner Kerne aus Fettgewebe für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich der RNA-Sequenzierung, zu umgehen. Die zelluläre Heterogenität kann dann durch RNA-Sequenzierung und bioinformatische Analysen analysiert werden.

Introduction

Studien haben gezeigt, dass braunes Fettgewebe (BAT) eine bemerkenswerte Fähigkeit hat, Energie abzuleiten. Zwei Arten von thermogenen Adipozyten mit unterschiedlichen Entwicklungsmerkmalen existieren sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen: Beige-Adipozyten und klassische braune Adipozyten. Während sich klassische braune Adipozyten meist in interscapularen BVT-Depots befinden, entstehen beige adipozyten sporadisch in weißem Fettgewebe (WAT) als Reaktion auf bestimmte physiologische Hinweise, wie chronische Kälteexposition, ein Prozess, der als “Browning” oder “Beiging” bezeichnet wird. Durch den Einsatz von fortgeschrittener Bildgebung ist nun klar, dass erwachsene Menschen über erhebliche Depots von UCP1+ BAT verfügen, insbesondere in der supktoicularen Region1,2,3,4. Die Menge der erwachsenen menschlichen BAT korreliert umgekehrt mit Fettleibigkeit und kann durch externe Hinweise erhöht werden, wie chronische Kälteexposition5,6 oder 3-adrenergen Rezeptoragonisten7. DIE von BVT vermittelten Energieausgaben können einen praktikablen Ansatz zur Bekämpfung von Fettleibigkeit bieten.

Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Studien haben jedoch die Existenz mehrerer Subtypen oder Subpopulationen aufgedeckt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratnutzung und Transkriptom8,,9,10unterscheiden. Zum Beispiel wurde kürzlich eine Art von Beige-Adipozyten beschrieben, die bevorzugt Glukose für die Thermogenese verwendet, die g-beige adipocyte, vor kurzem10beschrieben. Das unvollständige Verständnis von Zelltypen in braunem und beigeem Fettgewebe und das Fehlen spezifischer Marker stellen ein kritisches Hindernis für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen dar.

Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Subpopulationen von Zellen basieren auf der Expression nur einiger bekannter Markergene. Jüngste Fortschritte in der einzelzelligen Genomik ermöglichen die Verwendung globaler Genexpressionsdaten einzelner Zellen, um eine unvoreingenommene Schätzung der Anzahl der Subpopulationen in einem Gewebe zu liefern. Das Endziel dieses Protokolls ist es, alle Fettgewebe-Subtypen unter verschiedenen thermogenen Reizen in einer einzelzelligen Auflösung zu bestimmen. Im Gegensatz zu anderen Geweben und Zelltypen ist die Bestimmung zellulärer Subtypen von Fettgewebe aufgrund der Fragilität von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Dieses Papier führt ein robustes Protokoll ein, um einzelne Kerne aus Fettgewebe für die nachgeschaltete Anwendung zur SnRNA-Sequenzierung zu isolieren. Wichtig ist, dass aktuelle Literatur, die gut aufeinander abgestimmte Single-Nuklei-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) vergleicht, zeigte, dass snRNA-seq mit scRNA-seq in der Zelltyp-Detektion vergleichbar ist und in der zellulären Abdeckung für ein komplexes Gewebe wie das Gehirnüberlegen ist 11. Dieses Protokoll kombiniert eine Dichtegradientenzentrifugationsmethode, die von Rosen et al.12 für Fettgewebe optimiert wurde, mit einem “Cleanup”-Schritt der Kerne mit einem MoFlo XDP High Speed Sorter. Wie in den repräsentativen Ergebnissen zu sehen ist, identifizierte eine Analyse von 7.500 einzelnen Kernen aus dem interskapulären braunen Fettgewebe der Maus mehrere Zelltypen in scheinbar homogenen braunen Adipozyten. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um die Organisation von Adipozyten und adipose-residenten Zellen auf Gewebeebene, die Identifizierung subtypspezifischer Markergene und die Entwicklung von Phänotypisierung von adipose-selektiven Knockout/transgenen Mäusen zu untersuchen.

Protocol

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Albert Einstein College of Medicine genehmigt wurden. 1. Vorbereitung von Gewebeverdauungs- und Lysepuffern Bereiten Sie den Gewebeverdauungspuffer vor. Bereiten Sie für jedes Gramm Fettgewebe einen Verdauungspuffer von 1 ml vor. 1,5 U/ml Kollagennase D und 2,4 U/ml Dispase II abwägen und Phosphatgepufferte Saline (PBS) hinzufügen. …

Representative Results

Unsortierte Adipozytenkerne enthalten Trümmer und Doublets, die bei der nachgeschalteten einzelzelligen RNA-Sequenzierung Rauschen und hohen Hintergrund erzeugen. Die repräsentative FACS-Gate-Strategie ist in Abbildung 1dargestellt. Die Kerne wurden zuerst auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) (A) ausgewählt, dann wurden nur Singlets auf der Grundlage der Kombination von Breite und Höhen von SSC (B…

Discussion

Es wird eine einfache und robuste Methode zur Isolierung einzelner Kerne und zur Untersuchung der Heterogenität des Fettgewebes vorgestellt. Im Vergleich zur Sequenzierung der gesamten Gewebe-RNA bietet dieser Workflow einen unvoreingenommenen Blick auf die zelluläre Heterogenität und populationsspezifische Marker. Dies ist signifikant und innovativ für die Weiterentwicklung der Adipozytenbiologie, des molekularen Stoffwechsels und der Adipositasforschung.

Dieses Protokoll ist speziell fü…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken David Reynolds vom Albert Einstein Genomics Core und Jinghang Zhang vom Flow Cytometry Core für die technische Unterstützung. Wir würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (DK110426) und Pilot- und Machbarkeitsstipendien vom Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) und dem New York Obesity Research Center (DK026687) (alle nach K.S.). Wir danken auch Albert Einstein Cancer Center (CA013330) für die Kernunterstützung.

Materials

autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA Sigma A1595
CaCl2 Sigma 21115
Cell filter 100 μm Corning 431752
Cell filter 40μm Corning 431750
CellTrics (30 μm) Sysmex 04-004-2326
Collagenase D Roche 11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
DAPI Sigma D9542
Dispase II Roche 4942078001
HEPES Sigma H4034
KCl Fisher P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458 Stackable filters
MgCl2 Sigma M1028
MoFloXDP Cell Sorter Beckman Coulter ML99030
NP-40 Sigma 74385
Protector RNase Inhibitor Roche 3335402001
Sucrose Fisher S5-3

References

  1. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  2. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  3. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  4. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
  5. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  6. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  7. Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
  8. Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
  9. Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
  10. Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
  11. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
  12. Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  13. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
  15. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
  16. Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
  17. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
  18. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  19. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).

Play Video

Cite This Article
Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications. J. Vis. Exp. (160), e61230, doi:10.3791/61230 (2020).

View Video