Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula
Summary
Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.
Abstract
La grasa marrón y beige son tejidos adiposos especializados que disipan la energía para la termogénesis por UCP1 (Unacoupling Protein-1) y vías independientes. Hasta hace poco, los adipocitos termogénicos se consideraban una población homogénea. Sin embargo, estudios recientes han indicado que hay múltiples subtipos o subpoblaciones que son distintas en el origen del desarrollo, el uso del sustrato y el transcriptoma. A pesar de los avances en la genómica de una sola célula, la descomposición imparcial de los tejidos adiposos en subtipos celulares ha sido difícil debido a la naturaleza frágil de los adipocitos llenos de lípidos. El protocolo presentado fue desarrollado para eludir estos obstáculos mediante el aislamiento efectivo de núcleos únicos del tejido adiposo para aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de ARN. La heterogeneidad celular se puede analizar mediante secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos.
Introduction
Los estudios han demostrado que el tejido adiposo marrón (BAT) tiene una capacidad notable para disipar la energía. Existen dos tipos de adipocitos termogénicos con características de desarrollo distintas tanto en roedores como en humanos: adipocitos beige y adipocitos marrones clásicos. Mientras que los adipocitos marrones clásicos se encuentran principalmente en depósitos de BAT interescapulares, los adipocitos beige emergen esporádicamente en el tejido adiposo blanco (WAT) en respuesta a ciertas señales fisiológicas, como la exposición crónica al frío, un proceso conocido como “marrón” o “beiging”. Mediante el uso de imágenes avanzadas, ahora está claro que los seres humanos adultos tienen depósitos sustanciales de UCP1+ BAT, especialmente en la región supraclavicular1,2,3,4. La cantidad de BAT humano adulto se correlaciona inversamente con la adiposidad y puede aumentarse mediante señales externas, como la exposición crónica al frío5,6 o 3-adrenergic receptor agonista7. El gasto de energía mediado por los BAT puede ofrecer un enfoque viable para combatir la obesidad.
Hasta hace poco, los adipocitos termogénicos se han considerado una población homogénea. Sin embargo, los estudios han revelado la existencia de múltiples subtipos o subpoblaciones que son distintas en el origen del desarrollo, el uso del sustrato, y el transcriptoma8,,9,,10. Por ejemplo, recientemente se describió un tipo de adipocitos beige que utiliza preferentemente glucosa para la termogénesis, el adipocitos g-beige,10. La comprensión incompleta de los tipos de células en el tejido adiposo marrón y beige y la falta de marcadores específicos constituyen una barrera crítica para el estudio de sus funciones biológicas.
Los métodos tradicionales para aislar las subpoblaciones de las células se basan en la expresión de sólo unos pocos genes marcadores conocidos. Los avances recientes en la genómica de una sola célula permiten el uso de datos de expresión génica global de células individuales para proporcionar una estimación imparcial del número de subpoblaciones en un tejido. El objetivo final de este protocolo es determinar todos los subtipos de tejido adiposo bajo diversos estímulos termogénicos a una resolución de una sola célula. A diferencia de otros tejidos y tipos celulares, determinar los subtipos celulares del tejido adiposo es un desafío debido a la fragilidad de los adipocitos llenos de lípidos. Este documento introduce un protocolo robusto para aislar núcleos individuales del tejido adiposo para su aplicación posterior a la secuenciación de ARN. Es importante destacar que la literatura reciente que compara la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) y la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) reveló que el snRNA-seq es comparable al scRNA-seq en la detección de tipos de células, y superior en cobertura celular para un tejido complejo como el cerebro11. Este protocolo combina un método de centrifugación de gradiente de densidad optimizado para tejidos adiposos por Rosen et al.12 con un paso de “limpieza” de núcleos con un clasificador de alta velocidad MoFlo XDP. Como se ve en los resultados representativos, un análisis de 7.500 núcleos individuales del tejido adiposo marrón interescapular del ratón identificó múltiples tipos de células dentro de adipocitos marrones aparentemente homogéneos. En general, este protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización a nivel de tejido de adipocitos y células residentes en adiposos, la identificación de genes marcadores específicos de subtipos y el fenotipado de desarrollo de ratones noqueantes/transgénicos selectivos de adiposo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un método sencillo y robusto para aislar núcleos individuales y estudiar la heterogeneidad del tejido adiposo. En comparación con la secuenciación de ARN de tejido entero, este flujo de trabajo ofrece una visión imparcial de la heterogeneidad celular y marcadores específicos de la población. Esto es significativo e innovador para el avance de la biología adipocitos, el metabolismo molecular y la investigación de la obesidad.
Este protocolo está especialmente optimizado pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a David Reynolds del núcleo de Genómica Albert Einstein y Jinghang Zhang del Núcleo de Citometría de Flujo por el soporte técnico. Reconocemos el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (DK110426) y las Subvenciones Piloto y de Viabilidad del Centro de Investigación de diabetes Einstein-Mount Sinai (DK020541) y del Centro de Investigación de La Obesidad de Nueva York (DK026687) (todos a K.S.). También nos gustaría agradecer a Albert Einstein Cancer Center (CA013330) por el apoyo básico.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
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