Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon
Summary
Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.
Abstract
Kahverengi ve bej yağ UCP1 (Uncoupling Protein-1) bağımlı ve bağımsız yollar tarafından termogenez için enerji dağıtmak özel yağ dokuları vardır. Yakın zamana kadar, termojenik adipositler homojen bir popülasyon olarak kabul edildi. Ancak, son çalışmalar, gelişimsel köken, substrat kullanımı ve transkripsiyon olarak farklı birden fazla alt tip veya alt popülasyon olduğunu göstermiştir. Tek hücreli genomik gelişmelere rağmen, yağ dokularının hücre alt tiplerine tarafsız ayrışması lipid dolu adipositlerin kırılgan doğası nedeniyle zor olmuştur. Sunulan protokol, rna dizilimi de dahil olmak üzere, aşağı akım uygulamaları için yağ dokusundan tek çekirdeklerin etkili bir şekilde izole edilerek bu engelleri aşmak için geliştirilmiştir. Hücresel heterojenlik daha sonra RNA dizilimi ve biyoinformatik analizler ile analiz edilebilir.
Introduction
Çalışmalar kahverengi yağ dokusu (BAT) enerji dağıtmak için dikkate değer bir kapasiteye sahip olduğunu göstermiştir. Farklı gelişimsel özelliklere sahip iki tip termojenik adiposit ler hem kemirgenlerde hem de insanlarda bulunur: bej adipositler ve klasik kahverengi adipositler. Klasik kahverengi adipositler çoğunlukla interscapular BAT depolarında bulunurken, bej adipositler kronik soğuk maruziyet, “esmerleme” veya “beiging” olarak adlandırılan bazı fizyolojik ipuçlarına yanıt olarak beyaz yağ dokusunda (WAT) düzensiz olarak ortaya çıkarlar. Gelişmiş görüntüleme kullanımı sayesinde, yetişkin insanların ucp1 önemli depolar olduğu açıktır+ BAT, özellikle supraclavicular bölgede1,2,3,4. Yetişkin insan BAT miktarı ters yağ oranı ile ilişkilidir ve kronik soğuk maruziyet5,,6 veya β3-adrenerjik reseptör agonist7gibi dış ipuçları ile artabilir. BAT aracılı enerji harcamaları obezite ile mücadele için uygun bir yaklaşım sunabilir.
Yakın zamana kadar, termojenik adipositler homojen bir popülasyon olarak kabul edilmiştir. Ancak, çalışmalar gelişimsel kökenli farklı birden fazla alt tip veya alt popülasyonların varlığını ortaya koymuştur, substrat kullanımı, ve transkripsiyon8,9,10. Örneğin, tercihen termogenez için glikoz kullanan bej adiposit bir tür, g-bej adiposit, son zamanlarda tarif edildi10. Kahverengi ve bej yağ dokusundaki hücre tiplerinin eksik anlaşılması ve spesifik belirteçlerin olmaması biyolojik işlevlerinin incelenmesi için kritik bir engel oluşturmaktadır.
Hücrelerin alt popülasyonlarını yalıtma amaçlı geleneksel yöntemler, bilinen sadece birkaç marker geninin ekspresyonuna dayanır. Tek hücreli genomikteki son gelişmeler, tek hücreli küresel gen ekspresyonu verilerinin kullanılmasını sağlayarak bir dokudaki alt popülasyon sayısının tarafsız bir tahminini sağlar. Bu protokolün nihai amacı, tek hücreli çözünürlükte çeşitli termojenik uyaranlar altında tüm yağ dokusu alt tiplerini belirlemektir. Diğer doku ve hücre tiplerinin aksine, yağ dokusunun hücresel alt tiplerini belirlemek lipid dolu adipositlerin kırılganlığı nedeniyle zordur. Bu kağıt, tek çekirdekleri yağ dokusundan aşağı akım uygulamasına ve snRNA dizilimine izole etmek için sağlam bir protokol sunar. Daha da önemlisi, iyi eşleşen tek çekirdekli RNA sıralama (snRNA-seq) ve tek hücreli RNA sıralama (scRNA-seq) veri setleri karşılaştıran son literatür snRNA-seq hücre tipi algılama scRNA-seq karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koymuştur, ve beyin gibi karmaşık bir doku için hücresel kapsama üstün11. Bu protokol, Rosen ve ark.12 tarafından yağ dokuları için optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüj yöntemini Bir MoFlo XDP Yüksek Hızlı Sorter ile bir çekirdek “temizleme” adımı ile birleştirir. Temsili sonuçlarda görüldüğü gibi, fare interscapular kahverengi yağ dokusundan 7.500 tek çekirdek analizi görünüşte homojen kahverengi adipositler içinde birden fazla hücre tipi tespit. Genel olarak, bu basit ve sağlam protokol, adipositlerin ve yağ-yerleşik hücrelerin doku düzeyinde organizasyonu, alt tipe özgü marker genlerinin tanımlanması ve yağ seçici nakavt/transgenik farelerin gelişim fenomeniinin incelenmesi için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek çekirdekleri izole etmek ve yağ dokusu heterojenliğini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem sunulmuştur. Tüm doku RNA dizile karşılaştırıldığında, bu iş akışı hücresel heterojenite ve popülasyona özgü belirteçlerin tarafsız bir görünümünü sunar. Bu önemli ve adiposit biyoloji, moleküler metabolizma ve obezite araştırma gelişimi için yenilikçi.
Bu protokol özellikle snRNA-seq downstream uygulaması için optimize edin. MoFlo XDP Yüksek Hızlı So…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Albert Einstein Genomik çekirdeğinden David Reynolds’a ve Flow Sitometri Çekirdeği’nden Jinghang Zhang’a teknik destek için teşekkür ederiz. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (DK110426) ve Einstein-Mount Sinai Diyabet Araştırma Merkezi (DK020541) ve New York Obezite Araştırma Merkezi’nden (DK026687) (hepsi K.S.’e) pilot ve fizibilite hibelerinden destek kabul ediyoruz. Biz de albert Einstein Kanser Merkezi (CA013330) çekirdek desteği için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
