Micro-CT 화상 진찰을 위한 성인 및 초기 산후 마우스 폐의 혈관 주조
1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke,National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery,University of North Carolina at Chapel Hill
Summary
이 기술의 목적은 폐 인플레이션과 폐 동맥을 통해 무선 불투명 한 폴리머 기반 화합물의 주입을 통해 초기 산후 및 성인 마우스의 폐 동맥 네트워크의 전 생체 시각화입니다. 캐스팅된 조직에 대한 잠재적 응용 프로그램도 논의됩니다.
Abstract
혈관은 3 차원 공간에서 복잡한 네트워크를 형성합니다. 따라서 조직의 표면을 관찰하여 혈관 네트워크가 상호 작용하고 어떻게 작용하는지 시각적으로 이해하기가 어렵습니다. 이 방법은 폐의 복잡한 3차원 혈관 구조를 시각화하는 수단을 제공한다.
이를 달성하기 위해 카테터는 폐 동맥에 삽입되고 혈관은 동시에 혈액을 플러시하고 저항을 제한하기 위해 화학적으로 팽창됩니다. 폐는 표준 압력에서 기관을 통해 팽창하고 중합체 화합물은 표준 유량에 혈관 침대에 주입된다. 전체 동맥 망이 채워지고 치료할 수 있게 되면 폐 혈관은 마이크로 CT(μCT) 스캐너에서 직접 시각화되거나 이미지화될 수 있습니다.
성공적으로 수행 하면, 하나는 초기 산후 나이에서 성인에 이르기까지 쥐에 폐 동맥 네트워크를 감사할 수 있습니다. 또한 폐 동맥 침대에서 시연되었지만 이 방법은 최적화된 카테터 배치 및 끝점을 갖춘 혈관 침대에 적용할 수 있습니다.
Introduction
이 기술의 초점은 마우스에 있는 폴리머 기지를 둔 화합물을 사용하여 폐 동맥 건축의 시각화입니다. 뇌,,심장 및 신장1,2,2,,3,4,5와같은 전신 혈관 침대에서 광범위한 작업이 수행되었지만 폐 동맥 망의 준비 및 충진에 관한 정보가 적습니다. 따라서 이 연구의 목적은 전작6,,7,,8을 확장하고 조사관이 쉽게 따를 수 있는 상세한 서면 및 시각적 참조를 제공하여 폐 동맥 나무의 고해상도 이미지를 생성하는 것입니다.
자기 공명 영상, 에코카디그래피 또는 CT 혈관 조영술9,,10과같은 폐 혈관을 라벨링 및 이미징하기 위한 수많은 방법이 존재하지만, 이러한 양식의 대부분은 연구될 수 있는 것의 범위를 제한하여 작은 혈관을 적절히 채우거나 캡처하지 못합니다. 직렬 단면 및 재구성과 같은 방법은 고해상도를 제공하지만 시간 /노동 집약적11,,12,,13입니다. 주변 연조직 무결성은 전통적인 부식 주조10,,13,,14,,15,,16에서손상된다. 동물 의 나이와 크기조차도 카테터를 도입하려고 할 때 요인이되거나 해상도가 부족합니다. 반면에 폴리머 주입 기술은 동맥을 모세관 수준으로 채우고 μCT와 결합하면 비교할 수 없는 분해능5를허용합니다. 산후 14일의 어린 마우스 폐에서 샘플을 성공적으로캐스팅하고 몇 시간 만에 처리되었습니다. 이들은 기존연조직(17)을손상시키지 않고 조직학적 제제/전자 현미경검사(EM)를 위해 무기한 재스캔하거나 심지어 보내질 수 있다. 이 방법의 주요 제한 사항은 CT 장비/소프트웨어의 선행 비용, 혈관 내 압력을 정확하게 모니터링하는 데 어려움을 겪고 있으며 동일한 동물에서 세로로 데이터를 수집할 수 없다는 것입니다.
이 논문은 폐 동맥 주입 기술을 더욱 최적화하고 출생 후 날 1 (P1)까지 연령 / 크기 관련 경계를 밀어 눈에 띄는 결과를 산출하기 위해 기존의 작업을 기반으로합니다. 동맥 혈관 네트워크를 연구하려는 팀에게 가장 유용합니다. 따라서 카테터 배치/안정화에 대한 새로운 지침을 제공하고, 채우기 속도/볼륨에 대한 제어가 증가하고, 주조 성공증가를 위한 주목할 만한 함정을 강조합니다. 그런 다음 결과 캐스트를 향후 특성화 및 형태 분석에 사용할 수 있습니다. 아마도 더 중요한 것은, 이것은 이 복잡한 절차를 통해 사용자를 안내하는 우리의 지식에 대한 첫 번째 시각적 데모입니다.
Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 국립 심장 폐 및 혈액 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)에 의해 승인되었습니다. 1. 준비 헤파린 (1 단위 /g 마우스 체중)과 마우스 를 인내하여 2 분 동안 앰필 할 수 있도록하십시오. CO2 챔버에서 동물을 안락사시합니다. 수술 판의 척추 자세로 마우스를 준비하고 테이프로 네 개의 팔다리를 모두 보드에 고…
Representative Results
성공적인 캐스트는 전체 폐 동맥 네트워크의 균일 한 충전을 전시할 것입니다. 우리는 나이에 이르기까지 C57Bl/6J 마우스에서 이를 입증합니다: 산후일 P90(도 4A),P30(도 4B),P7(도 4C),및 P1(도 4D). 유량의 속도를 제어하고 실시간으로 채우기를 시각적으로 모니터링함으로써, 가장 단산적?…
Discussion
제대로 실행, 이 방법은 폐 동맥 네트워크의 눈에 띄는 이미지를 산출, 설치류 모델의 비교 및 실험을 허용. 길을 따라 몇 가지 중요한 단계는 성공을 보장합니다. 첫째, 조사관은 혈전이 심장의 폐 혈관과 챔버에서 형성되는 것을 방지하기 위해 준비 단계에서 동물을 헤아린해야합니다. 이를 통해 중합체 화합물의 완전한 동맥 통과를 가능하게 합니다. 둘째, 다이어프램을 뚫고 흉곽을 제거 할 때,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NHLBI 교내 연구 프로그램 (DIR HL-006247)에 의해 부분적으로 지원되었다. NIH 마우스 이미징 시설에서 이미지 수집 및 분석에 대한 지침을 주셔서 감사합니다.
Materials
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma – Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | SkyScan | 1172 | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B – MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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Cite This Article
Knutsen, R. H., Gober, L. M., Sukinik, J. R., Donahue, D. R., Kronquist, E. K., Levin, M. D., McLean, S. E., Kozel, B. A. Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61242, doi:10.3791/61242 (2020).