Beredning av Mesh-formade Engineered Hjärt vävnader som härrör från mänskliga iPS-celler för In Vivo hjärtinfarkt Reparation
Summary
Det nuvarande protokollet genererar mesh-formade konstruerade hjärt vävnader som innehåller kardiovaskulära celler som härrör från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller för att möjliggöra undersökning av cellimplantation terapi för hjärtsjukdomar.
Abstract
Det aktuella protokollet beskriver metoder för att generera skalbara, meshformade konstruerade hjärtvävnader (ECTs) som består av kardiovaskulära celler som härrör från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), som utvecklas mot målet för klinisk användning. HiPSC-härledda kardiomyocyter, endotelceller och vaskulär väggmålning celler blandas med gel matris och sedan hälls i en polydimetylsiloxan (PDMS) vävnad mögel med rektangulära interna förskjutna inlägg. Genom kultur dag 14 ECTs mogna till en 1,5 cm x 1,5 cm mesh struktur med 0,5 mm diameter myofiber buntar. Kardiomyocyter anpassa till den långa-axeln av varje bunt och spontant slå synkront. Detta tillvägagångssätt kan skalas upp till en större (3,0 cm x 3,0 cm) nät ECT samtidigt som konstruera mognad och funktion. Således, mesh-formad ECTs genereras från hiPSC-härledda hjärt celler kan vara genomförbart för hjärt regenerering paradigm.
Introduction
Många prekliniska studier och kliniska prövningar har bekräftat effektiviteten i cell-baserade hjärt regenerativa terapier för sviktande hjärtan1,2,3. Bland olika celltyper, mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är lovande cellkällor på grund av deras proliferativ förmåga, potential att generera olika kardiovaskulära härstamningar4,5, och allogenicity. Dessutom har vävnadsteknik gjort det möjligt att överföra miljontals celler till ett skadat hjärta5,6,7,8.
Tidigare rapporterade vi generering av tredimensionella (3D) linjära konstruerade hjärtvävnader (ECTs) från hiPSC-härledda kardiovaskulära härstamningar med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt odlingssystem för 3D bioartificial vävnader5,7. Vi fann att samexistensen mellan Vaskulär endotel celler och väggmålning celler med kardiomyocyter inom ECT underlättas strukturella och elektrofysiologisk vävnad mognad. Vidare validerade vi den terapeutiska potentialen av implanterade hiPSC-ECTs i en immun tolerant råtta hjärtinfarkt modell för att förbättra hjärtfunktionen, regenerera myokardium, och förbättra angiogenes5. De linjära ECT:erna konstruerade med denna metod var dock 1 mm gånger 10 mm cylindrar och därför inte lämpliga för implantationen i prekliniska studier med större djur eller klinisk användning.
Baserat på en framgångsrik användning av vävnad formar för att generera porösa konstruerad vävnadsbildning med hjälp av råtta skelett myoblaster och kardiomyocyter9, mänskliga ESC-härledda kardiomyocyter10 och mus iPSCs11, utvecklade vi ett protokoll för att generera skalbar hiPSC-härledda större implanterbar vävnad med hjälp av polydimetylsiloxan (PDMS) formar. Vi utvärderade en rad mögelgeometrier för att bestämma de mest effektiva mögelegenskaperna. Mesh-formade ECTs med flera buntar och korsningar uppvisade utmärkta egenskaper i cellens livskraft, vävnadsfunktion och skalbarhet jämfört med vanligt-ark eller linjära format som saknade porer eller korsningar. Vi implanterade nätformade ECT i en råtta hjärtinfarkt modell och bekräftade dess terapeutiska effekter liknar implanterade cylindriska ECTs12. Här beskriver vi protokollet för att generera en hiPSC-härledda mesh-formad ECT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter slutförandet av vår undersökning av ett linjärt format, hiPSC härledd ECT5, vi anpassade protokollet för att blanda hiPSC-härledda CMs, ECs och MCs för att underlätta in vitro-expansionen av vaskulära celler inom ECTs och efterföljande in vivo Vaskulär koppling mellan ECTs och mottagare hjärtmuskulatur.
För att underlätta generering av större, implanterbara mesh ECT geometrier vi använde tunna PDMS ark för att utforma 3D-formar med lastning inlä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Kosair Charities Pediatric Heart Research Program vid University of Louisville och Organoid Project vid RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSCs används i våra publicerade protokoll tillhandahölls av Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
