Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos
Summary
Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.
Abstract
As quinases de polinucleotídeos (PNKs) são enzimas que catalisam a fosforilação da extremidade hidroxila de 5′ do DNA e oligonucleotídeos de RNA. A atividade dos PNKs pode ser quantificada por meio de abordagens diretas ou indiretas. Apresentada aqui é uma abordagem direta e in vitro para medir a atividade PNK que se baseia em um substrato de oligonucleotídeo fluorescente e eletroforese de gel de poliacrilamida. Esta abordagem fornece a resolução dos produtos fosforilados, evitando o uso de substratos radiolabelados. O protocolo detalha como configurar a reação de fosforilação, preparar e executar grandes géis de poliacrilamida e quantificar os produtos de reação. A parte mais tecnicamente desafiadora deste ensaio é derramar e executar os grandes géis de poliacrilamida; assim, são fornecidos detalhes importantes para superar as dificuldades comuns. Este protocolo foi otimizado para o Grc3, um PNK que se reúne em um complexo de processamento de RNA pré-ribossômico obrigatório com seu parceiro de ligação, o nuclease Las1. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para medir a atividade de outras enzimas PNK. Além disso, este ensaio também pode ser modificado para determinar os efeitos de diferentes componentes da reação, como o triphosfato nucleosídeo, íons metálicos e oligonucleotídeos.
Introduction
As quinases de polinucleotídeos (PNK) desempenham papéis críticos em muitas vias de processamento de DNA e RNA, como reparação de DNA e conjunto ribossomo1,,2,,3,,4,,5. Essas enzimas fundamentais catalisam a transferência do monofosfato terminal (gama) de um triptofato nucleosídeo (NTP, na maioria das vezes ATP) para a extremidade hidroxila de 5′ de um substrato nucleotídeo. Um dos PNKs mais bem caracterizados é o bacteriófago T4 PNK, que tem ampla especificidade de substrato e é fortemente utilizado por laboratórios de biologia molecular para incorporar rótulos de isótopos radioativos no 5 terminus de um substrato de DNA ou RNA6,7,,8,,9,10,,11,12. Outro exemplo de enzima PNK é o CLP1, que é encontrado em Eukarya, Eubacteria e Archaea, e está implicado em várias vias de processamento de RNA4,,13,,14,15.
Historicamente, a maioria dos ensaios que medem a atividade de quinase polinucleotídeo dependem da rotulagem de isótopos radioativos e da autoradiografia subsequente5,16. Nos últimos anos, uma série de ensaios adicionais foram desenvolvidos para medir a atividade de PNK, incluindo abordagens de molécula única, eletroforese de microchip, balizas moleculares, bem como ensaios colorimétricos e baseados em luminescência17,,18,,19,,20,21,22. Embora muitas dessas novas abordagens forneçam limites de detecção aprimorados e evitem o uso de radioatividade, cada uma tem desvantagens, como custo, dependência de resina imobilizada e limitações na escolha do substrato.
Grc3 é um polinucleotídeo quinase que desempenha um papel fundamental no processamento do RNA pré-ribossômico2,3,23. Grc3 forma um complexo obrigatório com o endoribonuclease Las1, que corta o Spacer Transcrito Interno 2 (ITS2) do RNA pré-ribossômico3. O decote do ITS2 por Las1 gera um produto que abriga um hidroxil de 5′ que é posteriormente fosforilado pela quinase Grc33. Para investigar a especificidade do nucleotídeo e substrato do Grc3, foi necessário um ensaio barato que permitia o teste de diferentes substratos oligonucleotídeos. Por isso, foi desenvolvido um ensaio de fosforilação PNK usando substratos fluorescentes rotulados. Este ensaio foi usado com sucesso para determinar que o Grc3 pode utilizar qualquer NTP para atividade de transferência de fosforila, mas favorece o ATP24. Este protocolo adapta o ensaio original para medir a atividade PNK de Grc3 em uma mímica de RNA de seu substrato de RNA pré-ribossômico (SC-ITS2, Tabela 1). Um aspecto desafiador dessa abordagem baseada em fluorescência é a dependência de grandes géis de poliacrilamida para resolver efetivamente substratos fosforilados e não fosforilados. O protocolo fornece detalhes específicos sobre como derramar esses géis grandes e evitar armadilhas comuns ao fazê-lo.
Trabalhar com RNA requer cuidados particulares porque é fortemente suscetível à degradação. Existem medidas preventivas simples que se pode tomar para limitar a contaminação por ribonuclease. Uma estação de trabalho RNA separada que pode ser facilmente tratada com um agente de limpeza contendo inibidores de RNase é muitas vezes útil. É sempre necessário usar luvas ao manusear amostras e usar materiais de consumo certificados sem RNase. Como a água é outra fonte comum de contaminação, é melhor usar água recém-purificada e esterilizar todas as soluções usando um filtro de 0,22 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito é um ensaio para medir a atividade de quinase do Grc3 PNK em substratos de nucleotídeos fluorescentes. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar outras enzimas PNK adaptando o buffer de reação e o substrato de oligonucleotídeo. Por exemplo, o protocolo exige uma quantidade de traço de EDTA. A adição de EDTA é benéfica por duas razões: Primeiro, essa abordagem favorece o Grc3 ligado ao magnésio, impedindo que a enzima se ligue a vestígios de metais contaminantes na mistura. Em segundo lugar,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski pela leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramuros do Instituto Nacional de Saúde dos EUA; Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos EUA (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR; 146626 a M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
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