Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов
Summary
Этот протокол описывает нерадиоактивный анализ для измерения киназы активности полинуклеотидных кинасов (PNKs) на малых ДНК и РНК субстратов.
Abstract
Полинуклеотидные киназы (PNKs) являются ферментами, которые катализинцирует фосфорилирование 5′ гидроксилового конца ДНК и РНК-олигонуклеотидов. Активность НРК можно количественно оценить с помощью прямых или косвенных подходов. Представлено здесь прямой, in vitro подход к измерению активности PNK, который опирается на флуоресцентно помечены олигонуклеотид субстрат и полиакриламид гель электрофорез. Такой подход обеспечивает разрешение фосфорилированных продуктов, избегая при этом использования радиозабрюхированных субстратов. В протоколе подробно говорится о том, как настроить реакцию фосфорилирования, подготовить и запустить большие полиакриламидные гели, а также количественно определить реакционной продукции. Наиболее технически сложной частью этого анализа является заливка и запуск больших полиакриламидных гелей; таким образом, предоставляются важные детали для преодоления общих трудностей. Этот протокол был оптимизирован для Grc3, PNK, который собирается в обязательный предварительно рибосомный комплекс обработки РНК со своим связующим партнером, ядром Las1. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для измерения активности других ферментов PNK. Кроме того, этот анализ также может быть изменен для определения воздействия различных компонентов реакции, таких как нуклеозид трифосфат, ионы металла, и олигонуклеотиды.
Introduction
Полинуклеотидные киназы (PNK) играют важную роль во многих путях обработки ДНК и РНК, таких как ремонт ДНК и рибосомнаясборка 1,,2,,3,,4,,5. Эти фундаментальные ферменты катализирует перенос терминального (гамма) монофосфата из нуклеозидного трифосфата (NTP, чаще всего АТФ) в 5′ гидроксиловый конец нуклеотидного субстрата. Один из наиболее хорошо характеризуется PNKs является бактериофаг T4 PNK, который имеет широкую специфику субстрата и в значительной степени используется молекулярной биологии лабораторий для включения радиоактивных изотопов этикетки на 5 конечной части ДНК или РНКсубстрата 6,7,8,9,10,11,12. Другим примером фермента PNK является CLP1, который находится в Eukarya, Eubacteria, и Archaea, и замешан в нескольких путейобработки РНК 4,13,14,15.
Исторически сложилось так, что большинство анализов, которые измеряют активность полинуклеотида киназы зависят от радиоактивной маркировки изотопов и последующейауторадиографии 5,16. В последние годы был разработан ряд дополнительных анализов для измерения активности PNK, включая подходы к одной молекуле, электрофорез микрочипа, молекулярные маяки, а также колоритетрические и люминесцентныеанализы 17,,18,,19,,20,,21,,22. Хотя многие из этих новых подходов обеспечивают более расширенные пределы обнаружения и избегают использования радиоактивности, каждый из них имеет недостатки, такие, как стоимость, опора на иммобилизованную смолу и ограничения в выборе субстрата.
Grc3 является полинуклеотидной киназы, которая играет ключевую роль в обработке до рибосомнойРНК 2,3,23. Grc3 образует обязательный комплекс с эндорибонуклеазой Las1, которая расщепляет внутренний транскрибированный Spacer 2 (ITS2) до рибосомнойРНК 3. Расщепление ITS2 по Las1 генерирует продукт укрывательство 5′ гидроксил, который впоследствии фосфорилируется Grc3 киназы3. Для исследования нуклеотидной и субстратной специфичности Grc3 требовался недорогой анализ, который позволил провести тестирование различных олигонуклеотидных субстратов. Поэтому был разработан фосфорилирующий анализ PNK с использованием флуоресцентно помеченных субстратов. Этот анализ был успешно использован для определения того, что Grc3 может использовать любой NTP для передачи фосфорила деятельности, но выступает заАТФ 24. Этот протокол адаптирует исходный анализ для измерения активности PNK Grc3 на РНК, имитируя его до рибосомный субстрат РНК (SC-ITS2, таблица 1). Одним из сложных аспектов этого подхода, основанного на флуоресценции, является использование крупных полиакриламидных гелей для эффективного решения фосфорилированных и нефосфорилированных субстратов. Протокол содержит конкретные сведения о том, как залить эти большие гели и избежать распространенных ловушек при этом.
Работа с РНК требует особого ухода, поскольку она сильно подвержена деградации. Есть простые профилактические шаги можно предпринять, чтобы ограничить загрязнение рибонуклеазы. Отдельная рабочая станция РНК, которую можно легко лечить с помощью ингибитора RNase, содержащего моющие средства часто полезно. Всегда носить перчатки при обработке образцов и использование RNase без сертифицированных расходных материалов необходимо. Поскольку вода является еще одним распространенным источником загрязнения, лучше всего использовать свежеочищенную воду и стерилизовать все растворы с помощью фильтра 0,22 мкм.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный анализ для измерения активности киназы Grc3 PNK на флуоресцентно помеченных нуклеотидных субстратах. Этот протокол может быть применен для характеристики других ферментов PNK путем адаптации реакции буфера и олигонуклеотида субстрата. Например, протокол требует отслеживания к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Эндрю Сиккему и Андреа Каминский за их критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований Национального института здравоохранения США; Национальный институт наук об охране окружающей среды США (NIEHS; ЗИЯ ES103247 в Р.Е.С.) и Канадские институты исследований в области здравоохранения (CIHR; 146626 до M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. 생화학. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
