Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren
Summary
Ein vorwärtsgerichteter genetischer Screen, der auf der Ca2+-Höhe als Auslese basiert, führt zur Identifizierung genetischer Komponenten, die an kalziumabhängigen Signalwegen in Pflanzen beteiligt sind.
Abstract
Vorwärtsgenetische Screens waren wichtige Werkzeuge bei der unvoreingenommenen Identifizierung genetischer Komponenten, die an mehreren biologischen Pfaden beteiligt sind. Die Grundlage des Bildschirms ist es, eine mutierte Population zu erzeugen, die mit einem Phänotyp von Interesse gescreent werden kann. EMS (Ethylmethansulfonat) ist ein häufig verwendetes Alkylierungsmittel zur Induktion zufälliger Mutation in einem klassischen Vorwärts-Genbild, um mehrere Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten Prozess beteiligt sind. Zytosololische Kalzium (Ca2+) Höhe ist ein wichtiger früher Signalweg, der bei der Stresswahrnehmung aktiviert wird. Die Identität von Rezeptoren, Kanälen, Pumpen und Transportern von Ca2+ ist jedoch in vielen Studiensystemen noch immer schwer fassbar. Aequorin ist ein zelluläres Kalziumreporter-Protein, das aus Aequorea victoria isoliert und stabil in Arabidopsis exprimiert wird. Unter Ausnutzung dieser, haben wir einen vorwärts genetischen Bildschirm entworfen, in dem wir EMS-mutagenisiert die Aequorin transgen. Die Samen der mutierten Pflanzen wurden gesammelt (M1) und screening für den Phänotyp von Interesse wurde in der Segrekung (M2) Population durchgeführt. Mit einem 96-Well-High-Throughput Ca2+ Messprotokoll können mehrere neuartige Mutanten identifiziert werden, die eine unterschiedliche Kalziumantwort haben und in Echtzeit gemessen werden. Die Mutanten mit dem Phänotyp von Interesse werden gerettet und vermehrt, bis eine homozygote mutierte Pflanzenpopulation gewonnen wird. Dieses Protokoll bietet eine Methode für vorwärtsgerichtete genetische Bildschirme im Ca2+-Reporterhintergrund und identifiziert neuartige Ca2+ regulierte Ziele.
Introduction
Eine Veränderung der zytosolischen Kalziumkonzentration (Ca2+)bei wahrnehmungsgemäßem biotischem oder abiotischem Reiz ist ein gut untersuchtes frühentwickeltes Signalereignis, das viele Signalwege1,2,3,4aktiviert. Eine Zelle in ihrem basalen Ruhezustand behält eine niedrigere Ca2+-Konzentration im Cytosol und Sequester-Überschuss Ca2+ in verschiedenen intrazellulären Organellen und extrazellulären Apoplasten bei, was zu einem steilen Ca2+ Gradienten5,6führt. Bei der Signalwahrnehmung steigen ca2+-Spiegel im Cytosol aufgrund eines Zustroms von Ca2+ aus extrazellulären und/oder intrazellulären Quellen und erzeugen eine Reize spezifische Calciumsignatur7,8,9. Ca2+ Höhen im Cytosol werden durch viele Reize aktiviert, aber spezifität wird durch verschiedene Speicher, die Ca2+,eine einzigartige Ca2+ Signatur und geeignete Sensorproteine10,11.
Die Verwendung von Alkylierungsmittel, Ethylmethansulfonat (EMS) für die Mutagenese, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in klassischen vorwärtsgenetischen Bildschirmen, um mehrere unabhängige Gene zu identifizieren, die an einem Prozess beteiligt sind. EMS ist ein chemisches Mutagen, das hauptsächlich C bis T und G zu A überführt, nach dem Zufallsprinzip im gesamten Genom übergeht und eine Veränderung von 1 bp in jedem 125 kb des Genoms erzeugt. Die EMS-Mutagenese induziert 1000 Einzelbasispaaränderungen, entweder Insertion/Deletionen (InDel) oder Single Nukleotide Polymorphism (SNP) pro Genom12. EMS-induzierte Mutationen sind mehrfache Punktmutationen mit einer Mutationshäufigkeit von 1/300 bis 1/30000 pro Ort. Dies reduziert die1 Anzahl der M 1-Pflanzen, die benötigt werden, um eine Mutation in einem bestimmten Gen zu finden. Ein M 1-Saatgut-Bevölkerungsbereich von 2000-3000 wird in der Regel verwendet, um Mutationen von Interesse in Arabidopsis thaliana13,14zu erhalten.1
Aequorin-Transgenen sind Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) Ökotyp-Pflanzen, die p35S-Apoaequorin (pMAQ2) im Cytosol15exdrücken. Aequorin ist2+ ein Ca 2+-Bindungsprotein, das aus Apoprotein und einer prothetischen Gruppe besteht, die aus Luziferinmolekül Coelenterazin besteht. Die Bindung von Ca2+ an Aequorin, das drei Ca2+ bindende EF-Hands-Standorte hat, führt dazu, dass Coelenterazin oxidiert und gecyclt wird, um das Dioxetanon-Zwischenprodukt zu erhalten, gefolgt von einer konformen Veränderung des Proteins, begleitet von der Freisetzung von Kohlendioxid und Singlet-erregtem Coelenteramid16. Das so erzeugte Coelenteramid strahlt einmaxblaues Licht aus, das durch das Leuchtkraftmesser17erfasst werden kann. Die extrem schnellen Ca2+ Höhen können so in Echtzeit gemessen und für schnelle vorwärts gerichtete genetische Abschirmungen genutzt werden. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Spezifität der Kalzium-Antwort zu nutzen, um neue Schlüsselakteure zu identifizieren, die an der Ca2+-Signatur beteiligt sind. Um diese Aufgabe zu erfüllen, verwenden wir EMS-Mutagenese in transgenem Aequorin und identifizieren die SNPs, die mit veränderter Ca2+-Signalisierung verbunden sind. Das Protokoll identifiziert Mutanten, die keine oder reduzierte Ca2+-Höhen bei Anuleaddition aufweisen. Diese Mutanten können dann kartiert werden, um die Gene zu identifizieren, die für die Ca2+-Antwort verantwortlich sind. Die Methode ist auf jede Art von flüssigen Reizen in Pflanzen anwendbar, die zu einer Ca2+ Höhe führt. Da ca2+ Höhe eine der ersten Reaktionen in der Pflanzenabwehr Signalweg ist, kann die Identifizierung von vorgelagerten Reaktionskomponenten Kandidaten für die Gentechnik liefern, um widerstandsfähige Pflanzen zu entwickeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS-Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Mutationen in der Population zu erzeugen. Die klassischen Vorwärts-Gen-Screens, die EMS verwenden, waren aus zwei Hauptgründen ein wirksames Instrument, um neuartige Gene zu identifizieren: Erstens erfordern sie keine vorherigen Annahmen über die Genidentität, und zweitens führen sie keine Verzerrung ein. Es gibt mehrere Methoden, um ein Screening-Populationen wie EMS, T-DNA-Einfügungen, Strahlungen usw. zu erzeugen. Von allen Methoden hat die EMS-basierte Mutag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem National Institute of Plant Genome Research – Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale für das Videoshooting und dem Department of Biotechnology- eLibrary Consortium für den Zugang zu E-Ressourcen. Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology, Indien durch das National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max-Planck Gesellschaft-India Partner Group-Programm, unterstützt; und CSIR-Junior Research Fellowship (zu D.M und S.M) und Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (zu R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
