ニューロンの細胞密売研究のためのチューブ内の組換えBDNFを精製し、直接モノビオチン化するための改良されたプロトコル
Summary
Avi配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)は、コスト効率の高い方法でHEK293細胞で産生され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。BDNFaviは、その後、チューブ内の酵素BirAで直接モノビオチン化されます。BDNFaviおよびモノビオチン化BDNFaviは、市販のBDNFと比較して生物学的活性を保持します。
Abstract
アビ配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)はHEK293細胞で産生され、次いでアフィニティークロマトグラフィーによりコスト効率よく精製される。再現性のあるプロトコルは、酵素BirAをチューブに含むBDNFAviを直接モノビチン化するために開発されました。この反応において、モノビオチン化BDNFAviは、その生物学的活性を保持する。
ニューロトロフィンは、神経細胞の発達と維持に役割を果たすターゲット由来の成長因子です。それらは異なった神経区画間の長距離シグナリングを可能にするために、エンドサイトーの経路に沿って急速な輸送メカニズムを要求する。ニューロトロフィンの密売を研究するための分子ツールの開発により、生体内記録を用いた細胞内のこれらのタンパク質の正確な追跡が可能になりました。このプロトコルでは、モノビチン化BDNFの生産に対する最適化された費用対効果の高い手順を開発しました。ビオチン化可能なアビ配列(BDNFAvi)を含む組換えBDNF変異体を、HEK293細胞内でマイクログラム範囲で産生し、次いでアフィニティークロマトグラフィーを用いて容易にスケーラブルな手順で精製する。精製されたBDNFは、チューブ中の酵素BirAとの直接インビトロ反応によって均質にモノビオチン化することができる。モノビチン化BDNF(mbtBDNF)の生物活性は、異なるフルオロフォアにストレプトアビジン共役に結合することができる。BDNFAviおよびmbtBDNFは、ウェスタンブロットを用いた下流リン酸化標的の検出および転写因子CREBの活性化を通じて実証された生物活性を保持する。ストレプトアビジン量子ドットを用いて、リン酸化特異的抗体で検出されたCREBの活性化と共にmbtBDNFのインターナリゼーションを可視化することができました。さらに、ストレプトアビジン量子ドットに結合したmbtBDNFは、マイクロ流体室で成長した皮質ニューロンにおける逆行輸送解析に適していた。このように、チューブで生成されたmbtBDNFは、生理的シグナル伝達の内在ダイナミクスおよびニューロンの人身売買を研究するための信頼できるツールである。
Introduction
ニューロンは、シナプスコミュニケーションを可能にする複雑で特殊な形態を有する神経系の機能的単位であり、したがって、多様な刺激に応答して協調的で複雑な行動の生成である。樹状突起や軸索などの神経突起は、神経伝達に関与する重要な構造的特徴であり、ニューロトロフィンは形態と機能1を決定する上で重要な役割を果たします。ニューロトロフィンは、NGF、NT-3、NT-4、および脳由来神経栄養因子(BDNF)2を含む分泌成長因子のファミリーである。2中枢神経系(CNS)において、BDNFは神経伝達、樹状樹状の樹状化、樹状脊椎の成熟、長期増強、3,44を含む多様な生物学的プロセスに関与する。したがって、BDNFは神経機能の調節において重要な役割を果たす。
多様な細胞プロセスは、BDNFのダイナミクスと機能を調節します。神経細胞表面では、BDNFはトロポミオシン受容体キナーゼB(TrkB)および/またはp75ニューロトロフィン受容体(p75)に結合する。BDNF-TrkBおよびBDNF-p75複合体は、エンドサイトース化され、異なるエンドサイトオルガネラ55、6、7、86,7,8に分類される。BDNF/TrkB複合体の正しい細胞内の人身売買は、異なる神経回路9、10、1110における適切9なBDNFシグナル伝達のために必要と11される。このため、BDNFの人身売買ダイナミクスと病態生理学的プロセスにおけるその変化を深く理解することは、健康と疾患におけるBDNFシグナル伝達を理解するために不可欠である。このプロセスを監視する新しい特定の分子ツールの開発は、この分野を前進させ、関係する規制メカニズムをよりよく把握するのに役立ちます。
ニューロンの BDNF 人身売買の研究に利用できるいくつかのツールがあります。.一般的に使用される方法論は、GFP mCherry12,13の緑色蛍光タンパク質(GFP)または単量体蛍光赤シフト変異型などの蛍光分子でタグ付けされた組換えBDNFのトランスフェクションを13含む。しかし、BDNF過剰発現の主な欠点は、このニューロトロフィンの既知の濃度を提供する可能性を排除することです。また、細胞毒性をもたらし、結果14の解釈を隠す。別の戦略は、Flag-TrkBのようなエピトープタグ付きTrkBのトランスフェクションです。この方法論はTrkBの内在性ダイナミクス15の研究を可能にするが、それはまた、TrkB機能および細胞毒性の変化をもたらす可能性があるトランスフェクションを伴う。これらの方法論的ハードルを克服するために、ビオチンリガーゼ酵素BirAによって単一ビオチン化することができるアビ配列(BDNFAvi)を含むNGFおよびBDNFの組換え変異体が16,17,17に開発された。ビオチン化組換えBDNFは、フルオロフォア、ビーズ、常磁性ナノ粒子などを検出するための異なるストレプトアビジン結合ツールに結合することができる。ライブセルイメージングの面では、量子ドット(QD)は、小分子フルオロフォア18と比較した場合の光漂白に対する輝度および耐性の増加などの単粒子追跡に望ましい特性を有するため、頻繁に使用されるようになっている。
BDNFAviを用いたモノビオチン化BDNF(mbtBDNF)の生産は、BDNFAviとBirAの発現を駆動するプラスミドの共トランスフェクションによって達成され、続いて、10mLあたりBDNFの収率1〜2μgのBDNFの収率を有するアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製が行われた。ここでは、500 mLのHEK293コンディションメディアからのBDNFAvi精製を可能にするこのプロトコルの改変を提案し、操作を容易にするためのクロマトグラフィーカラムベースのプロトコルでタンパク質回収を最大化することを目指す。使用されたトランスフェクション剤、ポリエチレンイミン(PEI)は、トランスフェクション収率を犠牲にすることなく費用対効果の高い方法を保証する。モノビオチン化ステップは、共トランスフェクションに関連する合併症を回避し、BDNFの均質な標識を確実にするために、インビトロ反応に適応されています。mbtBDNFの生物活性は、微小流体室におけるBDNFの逆行軸索輸送を研究するためのpCREBおよび生細胞イメージングの活性化を含む、ウェスタンブロットおよび蛍光顕微鏡実験によって実証された。このプロトコルを使用すると、均質なモノビオチン化および生物学的に活性なBDNFの最適化された高収率生産が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、親和クロマトグラフィーベースの手順におけるmbtBDNFの生成および精製のための最適化された方法論が、Sungおよび共同研究者17の研究に基づいて説明される。最適化には、リポフェクタミンなどのより高価なトランスフェクション方法の効率を維持しながら、費用対効果の高いトランスフェクション試薬(PEI)の使用が含まれます。この最適化により、プロトコルの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、フォンデサイト(1171137)(FCB)、科学技術基礎優秀センター(AFB 170005)(FCB)、ミレニアム核(P07/011-F)(FCB)、ウェルカム・トラスト上級研究員賞(107116/Z/15/Z)からの財政的支援を感謝して認めている。この研究は、ウニダード・デ・ミクロスコフィア・アバンザダUC(UMA UC)によって支えられた。
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
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