Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen
Summary
Rekombinantes BDNF, das eine Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen kostengünstig hergestellt und durch Affinitätschromatographie gereinigt. BDNFavi wird dann direkt mit dem Enzym BirA in einer Röhre mono-biotinyliert. BDNFavi und monobiotinyd BDNFavi behalten ihre biologische Aktivität im Vergleich zu kommerziell erhältlichen BDNF.
Abstract
Rekombinantes BDNF, das eine Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen hergestellt und dann kostengünstig durch Affinitätschromatographie gereinigt. Ein reproduzierbares Protokoll wurde entwickelt, um BDNFAvi direkt mit dem Enzym BirA in einer Röhre zu monobiotinylatieren. In dieser Reaktion behält monobiotinylierte BDNFAvi seine biologische Aktivität bei.
Neurotrophine sind zielorientierte Wachstumsfaktoren, die eine Rolle bei der neuronalen Entwicklung und Wartung spielen. Sie erfordern schnelle Transportmechanismen entlang des endozytischen Weges, um Fernsignale zwischen verschiedenen neuronalen Kompartimenten zu ermöglichen. Die Entwicklung molekularer Werkzeuge zur Untersuchung des Handels mit Neurotrophinen hat die präzise Verfolgung dieser Proteine in der Zelle mit Hilfe von In-vivo-Aufnahmen ermöglicht. In diesem Protokoll haben wir ein optimiertes und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von monobiotinyliertem BDNF entwickelt. Eine rekombinante BDNF-Variante, die eine biotinylable Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen im Mikrogrammbereich hergestellt und dann in einem leicht skalierbaren Verfahren mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Der gereinigte BDNF kann dann durch eine direkte In-vitro-Reaktion mit dem Enzym BirA in einer Röhre homogen mono-biotinyliert werden. Die biologische Aktivität des monobiotinylierten BDNF (mbtBDNF) kann zu Streptavidin-konjugiert werden. BDNFAvi und mbtBDNF behalten ihre biologische Aktivität, die durch den Nachweis nachgeschalteter phosphorylierter Targets unter Verwendung von Western Blot bzw. Aktivierung des Transkriptionsfaktors CREB nachgewiesen wurde. Mit Streptavidin-Quantenpunkten konnten wir mbtBDNF-Internalisierung gleichzeitig mit der Aktivierung von CREB visualisieren, die mit einem Phospho-CREB-spezifischen Antikörper nachgewiesen wurde. Darüber hinaus eignete sich mbtBDNF konjugiert zu Streptavidin-Quantenpunkten für retrograde Transportanalysen in kortikalen Neuronen, die in mikrofluidischen Kammern angebaut wurden. So ist mbtBDNF in Derröhre ein zuverlässiges Werkzeug, um physiologische Signalisierungsdynamik und Handel mit Neuronen zu untersuchen.
Introduction
Neuronen sind die funktionellen Einheiten des Nervensystems, die über eine komplexe und spezialisierte Morphologie verfügen, die synaptische Kommunikation und damit die Erzeugung von koordiniertem und komplexem Verhalten als Reaktion auf verschiedene Reize ermöglicht. Neuronale Projektionen wie Dendriten und Axone sind kritische strukturelle Merkmale, die in der neuronalen Kommunikation beteiligt sind, und Neurotrophine sind entscheidende Akteure bei der Bestimmung ihrer Morphologie und Funktion1. Neurotrophine sind eine Familie von sezernierten Wachstumsfaktoren, die NGF, NT-3, NT-4 und Gehirn-abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF)2umfassen. Im Zentralnervensystem (ZNS) beteiligt sich BDNF an verschiedenen biologischen Prozessen wie Neurotransmission, dendritische Arborisierung, Reifung der dendritischen Stacheln, Langzeitpotenzierung, unter anderem3,4. Daher spielt BDNF eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der neuronalen Funktion.
Verschiedene zelluläre Prozesse regulieren die Dynamik und Funktion des BDNF. Auf der neuronalen Oberfläche bindet BDNF die Tropomyosin-Rezeptorkinase B (TrkB) und/oder den p75-Neurotrophinrezeptor (p75). BDNF-TrkB und BDNF-p75 Komplexe sind endocytosed und sortiert in verschiedenen endozytischen Organellen5,6,7,8. Korrekter intrazellulärer Handel des BDNF/TrkB-Komplexes ist für die korrekte BDNF-Signalisierung in verschiedenen neuronalen Schaltkreisen9,10,11erforderlich. Aus diesem Grund ist ein tiefes Verständnis der BDNF-Handelsdynamik und ihrer Veränderungen in pathophysiologischen Prozessen unerlässlich, um BDNF-Signale in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Die Entwicklung neuer und spezifischer molekularer Instrumente zur Überwachung dieses Prozesses wird dazu beitragen, diesen Bereich voranzubringen und ein besseres Verständnis der beteiligten Regulierungsmechanismen zu ermöglichen.
Es gibt mehrere Werkzeuge für die Studie des BDNF-Handels mit Neuronen. Eine häufig verwendete Methodik beinhaltet die Transfektion von rekombinantem BDNF, das mit fluoreszierenden Molekülen wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder der monomeren fluoreszierenden rot verschiebbaren Variante von GFP mCherry12,13getaggt ist. Jedoch, ein großes Manko der BDNF Überexpression ist, dass es die Möglichkeit der Bereitstellung bekannter Konzentrationen dieses Neurotrophin eliminiert. Auch, Es kann zu zellulären Toxizität führen, verdecken die Interpretation der Ergebnisse14. Eine alternative Strategie ist die Transfektion eines mit Epitopen markierten TrkB, wie Flag-TrkB. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der TrkB Internalisierungsdynamik15, aber es beinhaltet auch Transfektion, die zu veränderten TrkB-Funktion und zellulärer Toxizität führen könnte. Um diese methodischen Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Varianten von NGF und BDNF mit einer Avi-Sequenz (BDNFAvi), die durch das Biotinligase-Enzym BirA monobiotinyliert werden kann,entwickelt 16,17. Biotinyliertes rekombinantes BDNF kann mit verschiedenen Streptavidin-gebundenen Werkzeugen gekoppelt werden, darunter Fluorophore, Perlen, paramagnetische Nanopartikel, unter anderem zum Nachweis. In Bezug auf die Live-Zell-Bildgebung sind Quantenpunkte (QD) häufig verwendete Fluorophore geworden, da sie wünschenswerte Eigenschaften für die Verfolgung von Einzelpartikeln haben, wie erhöhte Helligkeit und Beständigkeit gegen Photobleichungen im Vergleich zu kleinen Molekülfluorophoren18.
Die Produktion von monobiotinyliertem BDNF (mbtBDNF) mit BDNFAvi wurde durch ko-Transfektion von Plasmiden erreicht, die die Expression von BDNFAvi und BirA antreiben, gefolgt von der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Affinitätschromatographie mit einer Ausbeute von 1-2 g BDNF pro 20 ml HEK293-konditionierte Kulturmedien17. Hier schlagen wir eine Änderung dieses Protokolls vor, die eine BDNFAvi-Reinigung von 500 ml HEK293-konditionierten Medien ermöglicht, die darauf abzielt, die Proteinrückgewinnung in einem chromatographie-spaltenbasierten Protokoll zu maximieren, um die Manipulation zu erleichtern. Das verwendete Transfektionsmittel Polyethylenimimin (PEI) sorgt für ein kostengünstiges Verfahren ohne Einbußen bei der Transfektionsausbeute. Der Monobiotinylisierungsschritt wurde an eine In-vitro-Reaktion angepasst, um die Mittransfektionen zu vermeiden und eine homogene Kennzeichnung von BDNF zu gewährleisten. Die biologische Aktivität des mbtBDNF wurde durch western blot und fluorescence mikroskopische Experimente demonstriert, einschließlich der Aktivierung von pCREB und Live-Zell-Bildgebung, um retrograde axonale Transport von BDNF in mikrofluidischen Kammern zu untersuchen. Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht eine optimierte, ertragreiche Produktion homogener monobiotinylierter und biologisch aktiver BDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wird eine optimierte Methodik für die Herstellung und Reinigung von mbtBDNF in einem Affinitätschromatographie-basierten Verfahren beschrieben, basierend auf der Arbeit von Sung und Mitarbeitern17. Die Optimierungen umfassen die Verwendung eines kostengünstigen Transfektionsreagenzes (PEI) unter Beibehaltung der Effizienz teurerer Transfektionsmethoden wie Lipofectamin. Diese Optimierung führt zu einer erheblichen Kostensenkung im Protokoll, die Skalierbarkeit bei gleichzeiti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung von Fondecyt (1171137) (FCB), dem Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), dem Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) und einem UK Dementia Research Foundation (GS). Diese Arbeit wurde von der Unidad de Microscopa Avanzada UC (UMA UC) unterstützt.
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
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