التصوير والتحليل لنقل الليفية العصبية في العصب الذبي الماوس المخزّن
Summary
نحن نصف أساليب التفكيك الضوئي الفلورية لتحليل النقل المحوري للاعصاب في محاور عصبية واحدة من الأعصاب النخاعية من الفئران المحورة وراثيا التي تعبر عن بروتين الليفية العصبية تنشيطية ضوئية.
Abstract
البوليمرات البروتين العصبية تتحرك على طول محاور في عنصر بطيء من النقل المحوري في متوسط سرعة ~ 0.35-3.5 مم / يوم. حتى وقت قريب كانت دراسة هذه الحركة في الموقع ممكنة فقط باستخدام وضع العلامات النبضية الإشعاعية ، والتي تسمح بتحليل النقل المحوري في الأعصاب الكاملة مع دقة زمنية للأيام ودقة مكانية من ملليمترات. لدراسة نقل الاعصاب في الموقع مع ارتفاع دقة الزمان والمكانية، وضعنا ماوس hThy1-paGFP-NFM المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين العصبي M الموسومة مع GFP تنشيطها في الخلايا العصبية. هنا نصف التضاء الضوئي تنشيط نبض الهروب والنبض انتشار أساليب لتحليل نقل neurofilament في محاور النخاعية واحدة من الأعصاب التيبية من هذه الفئران السابقين vivo. يتم الحفاظ على أجزاء العصب المعزولة على مرحلة المجهر عن طريق التسريب مع المالحة المؤكسجة وصورة عن طريق المجهر الفلوري الدوار القرص. يستخدم الضوء البنفسجي لتنشيط الفلوريس في نافذة قصيرة محور عصبي. يتم تحليل الفلوريس في المناطق المنشطة والحاصرة بمرور الوقت ، مما يسمح بدراسة نقل الليفية العصبية مع دقة زمنية ومكانية على ترتيب الدقائق والميكرنات ، على التوالي. يمكن استخدام النمذجة الرياضية لاستخراج المعلمات الحركية لنقل الاعصاب بما في ذلك السرعة والتحيز الاتجاهي والسلوك التوقف من البيانات الناتجة. ويمكن أيضاً تكييف طرق الهروب النبضي وانتشار النبض لتصور نقل الليفية العصبية في الأعصاب الأخرى. مع تطور فئران إضافية محورة وراثيا، يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب لتصوير وتحليل النقل المحوري للبروتينات الأخرى من الهيتوليات العظمية والبوليتوسولية في المحاور.
Introduction
وقد تجلى النقل المحوري للأعصاب لأول مرة في 1970s بواسطة الملصقات النبضية الإشعاعية1. وقد أسفرت هذه المقاربة عن ثروة من المعلومات حول نقل الاعصاب في الجسم الحي، ولكن لديها دقة مكانية وزمنية منخفضة نسبيا ، وعادة ما تكون على ترتيب ملليمترات وأيام في أحسن الأحوال2. وعلاوة على ذلك، فإن وضع العلامات بالنبض الإشعاعي هو نهج غير مباشر يتطلب حقن وتضحية متعددة لتوليد دورة زمنية واحدة. مع اكتشاف البروتينات الفلورسنت والتقدم في المجهر الفلوريس في 1990s، أصبح في وقت لاحق من الممكن لتصوير نقل neurofilament مباشرة في الخلايا العصبية المستزرعة على مقياس زمني من ثوان أو دقائق ومع شبه ميكرومتر التحليل المكاني، مما يوفر رؤية أكبر بكثير في آلية الحركة3. وقد كشفت هذه الدراسات أن البوليمرات العصبية في المحاور تتحرك بسرعة وبشكل متقطع في كل من الاتجاهات التيروغرادية والرجعية على طول المسارات ميكروتوب، مدفوعا البروتينات الحركية ميكروتوبول. ومع ذلك، الليفية العصبية هي هياكل محدودة الانعراج فقط 10 نانومتر في القطر التي عادة ما تكون متباعدة بعيدا عن جيرانها من قبل عشرات فقط من نانومتر; لذلك، لا يمكن تتبع البوليمرات إلا في الخلايا العصبية المستزرعة التي تحتوي على الليفية العصبية الموزعة بشكل غير قليل بحيث يمكن حل البوليمرات المتحركة من جيرانها4. وهكذا، فإنه ليس من الممكن في الوقت الحاضر لتتبع النخاع العصبي واحد في محاور عصبية تحتوي على البوليمرات العصبية وفيرة، مثل المحاور النخاعية.
لتحليل النقل المحوري للأعصاب في المحاور العصبية الغنية باستخدام المجهر الفلوريسنس ، نستخدم أسلوب الفلوريسينيشن الضوئي نبض الهروب التي وضعناها لدراسة السلوك التوقف على المدى الطويل من neurofilaments في الخلايا العصبية المستزرعة4،5. يتم تنشيط الليفية العصبية الموسومة ببروتين انصهار الفلورية الفلورية القابلة للفكّاق الضوئي في جزء قصير من محور عصبي ، ومن ثم يتم تحديد معدل مغادرة تلك الشعيرات من المنطقة المنشطة من خلال قياس اضمحلال الفلوريسانس بمرور الوقت. وميزة هذا النهج هو أن تحليل مستوى السكان لنقل الليفية العصبية التي يمكن تطبيقها على مقياس زمني للدقائق أو ساعات دون الحاجة إلى تتبع حركة البوليمرات الليفية العصبية الفردية. على سبيل المثال، استخدمنا هذه الطريقة لتحليل حركية نقل الاعصاب في الثقافات myelinating6.
في الآونة الأخيرة، وصفنا تطوير فأر hThy1-paGFP-NFM المعدلة وراثياً الذي يعبر عن مستويات منخفضة من بروتين الليفيلامين العصبي paGFP الموسومة M (paGFP-NFM) في الخلايا العصبية تحت سيطرة الإنسان العصبية الخاصة Thy1 المروج7. يسمح هذا الفأر بتحليل نقل الاعصاب في الموقع باستخدام المجهر المفلور. في هذه المقالة، نحن وصف النهج التجريبية لتحليل نقل النخاع العصبي في المحاور النخاعية من الأعصاب التيبية من هذه الفئران باستخدام نهجين. وأول هذه الأساليب هو طريقة الهروب النبضي الموصوفة أعلاه. هذه الطريقة يمكن أن تولد معلومات حول السلوك التوقف من neurofilaments، ولكن أعمى عن الاتجاه الذي خيوط مغادرة المنطقة المنشط، وبالتالي لا يسمح قياس اتجاه صافي وسرعة النقل8. والثاني من هذه الأساليب هو طريقة جديدة لانتشار النبض الذي نحلل فيه ليس فقط فقدان الفلوريسنس من المنطقة المنشطة، ولكن أيضا الزيادة العابرة في الفلوريسنس في نافذتين يحيطان بهما تتحرك خيوط الفلورسنت من خلالها وهي تغادر المنطقة المنشطة في الاتجاهين المتنثين والرجعي. في كلا النهجين، يمكن الحصول على معلمات نقل الليفية العصبية مثل متوسط السرعة والاتجاه الصافي وسلوك التوقف باستخدام التحليل الرياضي والنمذجة للتغيرات في الفلورس في نوافذ القياس. ويوضح الشكل 3 هذين النهجين.
هذا البروتوكول يدل على تشريح وإعداد العصب، وتفعيل وتصوير الفلوري paGFP، وتحديد كمي من نقل الليفية العصبية من الصور المكتسبة باستخدام حزمة توزيع فيجي من ImageJ9. نستخدم العصب التيبالي لأنه طويل (عدة سم) ولا يتفرع؛ ومع ذلك، من حيث المبدأ أي العصب التعبير عن paGFP-NFM مناسب للاستخدام مع هذه التقنية إذا كان يمكن تشريحها و de-غماد دون إتلاف محاور.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويجب توخي الحذر في تحليل تجارب الهروب النبضي وانتشار النبض لأن هناك إمكانية كبيرة لإدخال الخطأ أثناء المعالجة اللاحقة، ولا سيما أثناء التصحيح في الميدان المسطح، ومحاذاة الصور، وتصحيح التبييض. تصحيح الحقل المسطح ضروري لتصحيح عدم التوحيد في الإضاءة ، مما يؤدي إلى سقوط في كثافة عبر مجال ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ أن يشكروا بولا مونسما على التعليم والمساعدة في المجهر المجهري والتشريح العصبي التابي، والدكتور أتسوكو أوشيدا، وكلوي دوجر، وصناء شانده للمساعدة في تربية الفار. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المؤسسة الوطنية للعلوم التعاونية IOS1656784 إلى A.B. و IOS1656765 إلى P.J.، والمعاهد الوطنية لمنح الصحة R01 NS038526، P30 NS104177 وS10 OD010383 إلى A.B. N.P.B. تم دعمها من قبل زمالة من برنامج جامعة ولاية أوهايو للعلماء ما بعد الدكتوراه.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. 신경과학. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
